縫隙連接蛋白-43在膀胱出口部分梗阻的大鼠逼尿肌細胞膜中的表達

遲 強 王志勇 劉 英 彭偉彬 王澤民 宋殿賓 周逢海

(承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院泌尿外科,河北 承德 067000)

在心血管疾病的基礎研究中發(fā)現(xiàn)縫隙連接介導的細胞間通訊參與了細胞間的興奮傳導〔1〕?？p隙連接介導的細胞間通訊直接參與相鄰細胞間神經信號的傳收縮方面發(fā)揮重要作用〔2～4〕。Haefliger等〔5,6〕通過實驗發(fā)現(xiàn)縫隙連接蛋白-43(Cx-43)是大鼠逼尿肌細胞中重要的連蛋白。在人類的逼尿肌細胞中同樣發(fā)現(xiàn)了Cx-43與Cx-45。在一項關于排尿功能障礙的研究中發(fā)現(xiàn)Cx-43在逼尿肌中的表達發(fā)生改變。Fry等〔7,8〕指出逼尿肌的興奮依賴于縫隙連接的存在。本實驗探討膀胱出口部分梗阻(P-BOO)的大鼠逼尿肌細胞膜上縫隙連接和Cx-43表達的變化。

1 材料與方法

1.1P-BOO動物模型的建立 33只10周齡雌性Wistar大鼠，體重170～260 g，均由北京維通利華實驗動物有限公司提供〔動物合格證SCXK(京)2007-0009、SPF級〕。隨機分為兩組：模型組中造模后2 w處死6只；造模后4 w處死6只；造模后8 w處死6只。假手術組中2 w處死5只；4 w處死5只；8 w處死5只。上述各組大鼠處死后取膀胱逼尿肌組織進行后期實驗。P-BOO動物模型的建立參照Mattiasson等〔9，10〕的造模方法。大鼠通過腹腔注射25%烏拉坦(1 g/kg)麻醉后，用硬膜外導管(直徑1 mm)經尿道插入膀胱，小心游離尿道,游離至近膀胱頸口處，4-0 PGLA醫(yī)用可吸收絲線結扎近膀胱頸口處尿道,結扎松緊度以線結剛靠近尿道為宜，拔出導管,縫合皮膚。假手術組操作同上，但不結扎尿道。

1.2排尿壓測定 將實驗大鼠，25%烏拉坦(1 g/kg)腹腔注射麻醉〔11〕，仰臥固定，用硬膜外導管(直徑1 mm)經尿道插入膀胱，硬膜外導管接經三通管與尿動力儀及微量泵(UDS-600,加拿大)相連。標定零點，生理鹽水經微量灌注泵向膀胱灌注，速度為 0.2 ml/min〔12〕，同步記錄隨容積增加膀胱壓力波形、大小變化，至尿道口周圍溢水定義為膀胱最大容量(灌注速度×灌注時間=膀胱最大容量)并記錄膀胱殘余尿量。

1.3免疫組織化學檢測 所有膀胱逼尿肌樣本均用4%的多聚甲醛浸泡固定，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片。隨后加入一抗兔抗大鼠的Cx-43多克隆抗體(1∶100武漢博士德生物工程有限公司)，過氧化物酶標記的二抗(1∶100武漢博士德生物工程有限公司)。對照組中用0.01 mmol/L PBS (武漢博士德生物工程有限公司)代替一抗作陰性對照。

1.4冰凍蝕刻分析 樣本加戊二醛固定，隨后加入30%的甘油緩沖液，置入液氮中冷凍。樣本在-112℃的冷凍斷裂機(JFD-7000 日本)中被反復破碎斷裂。樣本在次氯酸鈉溶液中被消化，隨后加入濃度為1∶1的甲基氯仿對丙烯基苯酚和100%二甲基甲酰胺。將復合物置于網(wǎng)格中在透射電子顯微鏡(JEM-1210 日本)下觀察。

1.5Western 印跡檢測 膀胱逼尿肌組織被剔除黏膜層后加入1 mmol/L碳酸氫鈉(NaHCO3)溶液和2 mmol/L苯基甲磺酰氟化物蛋白酶抑制劑的混合片劑(Roche 美國)，同時經高頻聲波處理。Western 印跡和SDS-PAGE 電泳(每個泳道上樣40 μg)。為了檢測Cx-43的含量，先后加入兔抗大鼠的Cx-43多克隆抗體和用過氧化物酶標記的熒光二抗。檢測結果采用增強化學發(fā)光法顯色，X光片曝光顯影，凝膠圖像處理系統(tǒng)(EPA-3000 日本)分析目標帶的分子量和凈光密度值。

1.6統(tǒng)計學分析 組間數(shù)據(jù)的差異性比較行Mann-Whitney U test檢驗。

2 結 果

2.1膀胱重量及容量 模型組大鼠的膀胱重量較假手術組大鼠顯著增加(P<0.01)。在術后4 w和8 w模型組大鼠的膀胱容積較術后2 w顯著增加(P<0.05)。見表1。

2.2膀胱測壓結果 在假手術組中大鼠的排尿模式正常。在術后2 w模型組大鼠的排尿壓較假手術組顯著增加。然而，模型組中術后4 w大鼠的排尿壓較術后2 w顯著降低。在模型組中術后8 w大鼠的逼尿肌沒有發(fā)生收縮，同時出現(xiàn)尿失禁現(xiàn)象(圖1)。

表1 兩組膀胱重量及容積比較±s)

圖1 兩組大鼠膀胱測壓結果比較

2.3大鼠逼尿肌細胞膜中Cx-43的免疫組織化學染色結果 術后2 w模型組大鼠的逼尿肌細胞膜、胞質、胞核中均有Cx-43表達。術后4 w模型組大鼠逼尿肌細胞的胞質、胞核和胞膜上均有部分CX-43表達。然而，術后8 w模型組大鼠逼尿肌細胞中Cx-43主要被檢測到在胞質或胞核中，胞膜未見其表達。假手術組大鼠的逼尿肌細胞中Cx-43的表達未見異常。模型組中隨著術后時間的延長，Cx-43的表達也隨之降低：2 w 100%；4 w 76.4%±2.3%；8 w 4.3%±1.6%。見圖2。

2.4縫隙連接的形態(tài)學分析 每個縫隙連接像凝聚的圓形顆粒圖3。在假手術組大鼠逼尿肌中存在許多縫隙連接，并且每個網(wǎng)格中縫隙連接的數(shù)量分別為：術后2 w 3.2±0.12；術后4 w 2.1±0.77；術后8 w 3.0±0.57。模型組大鼠逼尿肌中縫隙連接的數(shù)量在對應時間內較假手術組顯著降低(P<0.05)，分別為：術后2 w 1.7±0.42；術后4 w 1.1±0.55；術后8 w沒有檢測到縫隙連接的存在?？p隙連接的形態(tài)在兩組中沒有差異(P>0.05)。見圖3。

A假手術組；B假手術組術后8 w；C陰性對照組；D模型組術后2 w；E模型組術后4 w；F模型組術后8 w

假手術組 模型組

2.5Western 印跡檢測與SDS-PAG電泳結果 假手術組中Cx-43在術后2、4、8 w中的表達分別為(4.13±0.71)、(4.25±0.5)、(4.64±0.82)。模型組中Cx-432、4、8 w中的表達分別為(8.09±0.43)、(8.37±0.36)、(11.27±0.69)，較假手術組顯著增高(P<0.05)。在模型組中Cx-43的表達隨時間的延長而逐漸增強。見圖4。

圖4 Cx-43的免疫蛋白印記分析

3 討 論

P-BOO常繼發(fā)于慢性前列腺增生，一般認為膀胱逼尿肌細胞的增生、肥大是該病的病理學基礎。這些組織學的改變伴隨相應的功能改變，包括殘余尿量增多，尿頻及排尿壓的改變?？p隙連接是通過位于相鄰細胞膜之間的連接子構成，其化學成分為六聚體的連接蛋白。目前發(fā)現(xiàn)在人體中至少有13種縫隙連接蛋白基因?？p隙連接蛋白介導的細胞間通訊可能在調控胚胎的發(fā)育，細胞的生長、分化等方面發(fā)揮重要作用?？p隙連接是人體及動物細胞膜上的特殊結構，構成了相鄰細胞間的特殊通道，信息離子(包括鈣離子)及小分子可通過此通道進入細胞間的轉運，調節(jié)許多重要的生理功能。

通過縫隙連接介導的細胞與細胞間的信息通訊對排尿功能調節(jié)有密切關系。術后2 wCx-43在兩組大鼠逼尿肌細胞膜上均有表達，說明逼尿肌的收縮是通過縫隙連接介導的。結果提示細胞膜上Cx-43表達降低導致了縫隙連接介導的細胞間通訊障礙。通過電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)模型組大鼠逼尿肌中隨著梗阻時間的延長縫隙連接數(shù)量逐漸減少。因此，Cx-43在細胞膜上表達的降低與逼尿肌的收縮和梗阻時間呈平行關系。

Christ等〔13〕報道在膀胱過度活動癥的大鼠逼尿肌中Cx-43 mRNA和蛋白表達是顯著增加的。在本研究中發(fā)現(xiàn)Cx-43在模型組中的表達較假手術組顯著增強，并且通過制造P-BOO導致Cx-43在逼尿肌中的表達上調。Cx-43的表達上調與Cx-43在胞膜中的表達下降可能是由于P-BOO所致逼尿肌細胞過分拉伸。

國外報道Cx-43參與膀胱壁收縮來增加排尿壓。然而，逼尿肌的收縮和Cx-43的定位沒有明確〔14〕。Cx-43的表達位置在研究縫隙連接耦聯(lián)功能上發(fā)揮重要作用〔15～17〕。本實驗結果提示在P-BOO的大鼠逼尿肌細胞膜上Cx-43的表達是降低的。因此，當Cx-43不能表達在逼尿肌細胞膜上時膀胱逼尿肌細胞是不能發(fā)生同步收縮的。

在膀胱逼尿肌中縫隙連接介導的細胞間通訊的功能障礙，究其原因是因為Cx-43在逼尿肌細胞膜上的表達降低所致。因此，正常的電信號不能在逼尿肌細胞中傳遞，致使排尿功能障礙。所以，縫隙連接的改變可能是導致排尿功能障礙性疾病發(fā)生的原因之一。

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