免疫因素在大鼠肺缺血再灌注損傷中的作用

倪程耀 陳 新 吳勝軍

(浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院心胸外科，浙江 杭州 310053)

肺缺血再灌注(I/R)損傷(LIRI)常發(fā)生在體外循環(huán)手術(shù)、肺移植、肺栓塞治療恢復血液供應后，再灌注引起的組織及器官的損傷〔1〕，臨床癥狀多表現(xiàn)為不減輕反而加重。LIRI是個復雜的病理過程，其機制至今不明，研究〔2〕發(fā)現(xiàn)其與氧自由基、炎性因素、肺部組織細胞損傷有密切相關(guān)。LIRI后，出現(xiàn)炎性細胞聚集，細胞因子大量表達，并且免疫因子基因敲除鼠的梗死面積明顯減少，進一步提示免疫因素在LIRI中存在重要作用。本研究觀察LIRI模型鼠中白細胞及相關(guān)細胞因子的變化，來探討免疫因素在LIRI中的作用。

1 對象與方法

1.1實驗動物及分組 選取90只健康雄性Wistar大鼠，體重200～300 g，隨機分為3組，每組30只。I/R組，行左肺I/R；Sham組(假手術(shù)組)，只開胸而不行左肺I/R；C組，對照組，不采取任何干預措施，只放血處死大鼠。

1.2動物模型建立 經(jīng)耳緣靜脈注射30 mg/kg的苯巴比妥鈉麻醉，氣管切開后插管，接動物呼吸機控制呼吸，呼吸頻率60次/min，潮氣量單側(cè)肺通氣8～10 ml/kg，雙側(cè)肺通氣15～20 ml/kg，呼吸比1∶2。然后經(jīng)胸骨右緣第3～5肋間開胸，離斷周圍組織，游離左肺門，呼氣末時結(jié)扎右肺門，60 min后開放行再灌注120 min，制成體外肺I/R模型。

1.3標本采集及檢測方法 各組于缺血30 min、再灌注60、120 min時采集標本。采集支氣管肺泡灌洗液(BALF)，采用考馬斯亮藍染色法對其總蛋白(TP)的測定，收集支氣管肺泡灌洗液沉渣，白細胞計數(shù)(WBC)，并采用瑞氏染色進行白細胞分類，計算中性粒細胞(PMN)的百分比；取一定的肺組織，應用天平稱量其濕質(zhì)量(W)，置于70℃烤箱烘烤48 h后，測量其干質(zhì)量(D)，W與D比值即為肺組織的濕/干重比(W/D)；取肺組織配制成10%的組織勻漿，腫瘤壞死因子(TNF)-α，IL-1，IL-6，IL-8含量采用ELISA檢測。

1.4統(tǒng)計學方法 應用SPSS17.0統(tǒng)計學應用軟件對各數(shù)據(jù)的組間比較進行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1BALF中蛋白含量、炎性細胞計數(shù)及W/D比值的變化 對應時間點W/D比值、WBC、PMN所占比值及TP含量在C組，Sham組及I/R組中的缺血30 min組不存在統(tǒng)計學差異(P>0.05)；I/R組再灌注60及120 min時，W/D比值、WBC、PMN所占比值及TP含量明顯高于C組及Sham組的對應時間點(P<0.05)；I/R組再灌注120 min時，W/D比值、WBC、PMN所占比值及TP含量明顯高于I/R組中再灌注60 min(P<0.05)。見表1，表2。

表1 各組W/D比值及BALF中WBC比較±s,n=30)

2.2肺組織勻漿TNF-α、IL-1、IL-6及IL-8含量的變化 對應時間點肺組織勻漿TNF-α、IL-1、IL-6及IL-8含量在C組、Sham組不存在統(tǒng)計學差異(P>0.05)；I/R組中缺血30 min，肺組織勻漿TNF-α含量明顯高于C組及Sham組(P<0.05)，肺組織勻漿IL-1、IL-6及IL-8含量與C組及Sham組無明顯差異(P>0.05)；I/R組再灌注60及120 min時，肺組織勻漿TNF-α、IL-1、IL-6及IL-8含量明顯高于C組及Sham組(P<0.05)；I/R組中再灌注120 min時，肺組織勻漿TNF-α、IL-1、IL-6及IL-8含量明顯高于I/R組中再灌注60 min(P<0.05)。見表3。

表2 各組BALF中PMN、TP水平比較±s,n=30)

表3 各組肺組織勻漿TNF-α、IL-1、IL-6及IL-8含量的變化±s，pg/ml,n=30)

3 討 論

近年來，心肺置換術(shù)、心肺轉(zhuǎn)流術(shù)已經(jīng)成為醫(yī)治晚期心肺疾病的重要手段，然而因LIRI的存在，導致臨床治療情況不減輕反而加重，成為患者術(shù)后恢復健康的重要障礙，肺移植術(shù)后因LIRI導致死亡的概率高達16%～25%〔3〕。關(guān)于LIRI的發(fā)病機制至今不明，多數(shù)研究認為其與以下因素有關(guān)，氧自由基的釋放及脂質(zhì)過氧化反應，鈣穩(wěn)態(tài)的失衡，炎性物質(zhì)的浸潤及免疫因素的干擾，細胞凋亡，其中免疫作用在其中占舉足輕重的地位。

免疫因素可通過以下途徑參與LIRI的發(fā)病機制中：①炎性細胞因子與相應受體結(jié)合，激活溶酶體使其溶解消化肺組織；②刺激血管內(nèi)皮細胞分泌黏附分子，增加白細胞的黏附作用及聚集作用；③刺激巨噬細胞分泌趨化性因子，加重炎癥反應，可使PMN大量聚集，導致細胞壞死，釋放過氧化物和溶酶體酶等，加劇了免疫反應，從而導致肺組織的損傷〔4～6〕。已有研究表明，在LIRI后的肺泡灌洗液中，TNF-α、IL-1、IL-6及IL-8細胞因子含量顯著高于血漿中水平，提示了免疫反應在LIRI的重要性〔7〕。本研究說明在再灌注中確實存在肺組織的損傷，且隨再灌注時間的推移，損傷呈加重趨勢；在LIRI損傷部位，存在較多的白細胞以及PMN的聚集，且這種聚集作用隨疾病進展逐漸加劇。TNF-α、IL-1、IL-6及IL-8均參與LIRI的發(fā)病機制中。炎性細胞因子含量隨疾病的進程存在著相對應的變化。這一研究結(jié)果與國內(nèi)相關(guān)研究基本吻合〔8，9〕，提示免疫因素在LIRI疾病中起著重要作用。

綜上所述，LIRI主要病理改變?yōu)榉谓M織內(nèi)皮的廣泛破壞，肺毛細血管通透性的增加，從而導致肺泡和間質(zhì)的水腫和損傷，其機制復雜，早期給予干預措施，可以大大提高治愈率和預后恢復。免疫因素，尤其是炎性細胞因子，在LIRI的疾病進展中發(fā)揮重要作用，因此針對病情應用抗炎性藥物可能減輕LIRI對組織器官的損傷。

4 參考文獻

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