丹皮酚對人MCF-7乳腺癌細(xì)胞PI3K/Akt mRNA表達的影響

王建杰 董 航 王茉琳 羅文哲 齊建祥

(佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

在前期的研究工作中，已經(jīng)報道了丹皮酚對人乳腺癌細(xì)胞株(MCF-7)細(xì)胞具有抑制作用并誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞的凋亡〔1〕，本研究進一步地探討丹皮酚對MCF-7細(xì)胞磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)、蛋白激酶B(Akt)mRNA表達的影響，闡明PI3K/Akt在丹皮酚誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程中的意義，為丹皮酚治療乳腺癌提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1材料 人MCF-7購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所細(xì)胞庫。RPMI 1640 培養(yǎng)液、Trizol來自Gibco公司，胎牛血清來源于Hyclone 公司。四甲基偶氮唑藍(lán)( MTT)為北京拜爾迪生物技術(shù)公司產(chǎn)品。二甲基亞砜( DMSO) 為Sigma公司產(chǎn)品。Annexin-V異硫氰酸熒光素(FITC)試劑盒購于Beyotime 公司。反轉(zhuǎn)錄cDNA 合成試劑盒為大連TaKaRa 生物公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞于9 cm 細(xì)胞培養(yǎng)皿中，加入10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)液，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d傳代1次。實驗于細(xì)胞處于對數(shù)生長期時進行。

1.3MTT法檢測丹皮酚對MCF-7 細(xì)胞增殖活性的影響 細(xì)胞胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞密度至5×104～1×105/ml，接種于96 孔培養(yǎng)板中，每孔100 μl，培養(yǎng)24 h，加入不同濃度(7.81、15.63、31.25、62.5、125、250 mg/L)的丹皮酚，每個濃度設(shè)4 個平行孔，用RPMI1640 完全培養(yǎng)液作為對照，設(shè)空白調(diào)零，放于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h 后，每孔加入5 mg/ml的MTT 20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，加入200 μl DMSO 溶液，于492 nm處測OD 值，計算細(xì)胞生長抑制率。細(xì)胞增殖抑制率(%) = (1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%。

1.4吖啶橙/溴乙啶(AO/EB)染色觀察藥物處理后細(xì)胞形態(tài) 5×104個/ml細(xì)胞接種于6孔板，每孔3 ml，24 h后，棄培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗，60 mg/L丹皮酚處理細(xì)胞，RPMI1640為陰性對照，培養(yǎng)48 h后，PBS清洗，每孔加入300 μl 4%甲醛固定液室溫固定30 min，再加入100 μlAO與100 μl EB(終濃度均為10 μg/ml)混勻，4℃避光20 min，熒光顯微鏡下觀察(激發(fā)波長545 nm)。

1.5Annexin-V FITC染色后流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞凋亡數(shù) 5×104個/ml細(xì)胞懸液接種于6孔板，每孔3 ml，24 h 后以60 mg/L丹皮酚處理細(xì)胞，RPMI1640 為對照，48 h后，胰酶消化，收集細(xì)胞，按試劑盒說明書操作，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率，激發(fā)波長488 nm。以Cell Quest 軟件分析結(jié)果。

1.6RT-PCR法檢測PI3K/Akt mRNA的表達 細(xì)胞經(jīng)過60 mg/L丹皮酚處理48 h后，Trizol法提取總RNA，RT-PCR一步法試劑盒轉(zhuǎn)錄，PI3K、Akt和β-actin引物自行設(shè)計完成，序列和擴增的帶長如下：PI3K：上游：5′-AGGAGCGGTACAGCAAAGAA-3′，下游:5′-GCCGAACACCTTTTTGAGTC-3′，長度270bp；Akt：上游:5′-TTTATTGGCTACAAGGAACG-3′，下游:5′-AGTCTGAATGGCGGTGGT-3′，213 bp；β-actin：上游：5′-TCAGGTCATCACTATCGGCAAT-3′，下游:5′-AAAGAAAGGGA GTAAAACGCA-3′，432 bp。反應(yīng)條件：PI3K：94 ℃，預(yù)變性3 min，94℃，變性30 s，53℃，退火30 s，72 ℃，延伸45 s，32 個循環(huán); Akt: 94℃預(yù)變性3 min, 94℃，變性30 s，55 ℃，退火30 s，72 ℃延伸45 s，32 個循環(huán)。β-actin: 94℃預(yù)變性3 min，94℃，變性30 s，57 ℃，退火30 s，72 ℃延伸45 s，32 個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析各條帶，計算PI3K/β-actin、Akt/β-actin的值。

2 結(jié) 果

2.1丹皮酚對細(xì)胞增殖活性的影響 丹皮酚處理MCF-7 細(xì)胞24 h的IC50高于250 mg/L，而丹皮酚處理MCF-7 細(xì)胞48 h后的IC50約是60 mg /L，說明丹皮酚作用48 h后對MCF-7 細(xì)胞增殖具有直接抑制作用，并呈劑量依賴性關(guān)系。后續(xù)實驗以60 mg/L濃度進行。

2.2AO/EB染色后細(xì)胞形態(tài) 鏡下觀察可見對照組細(xì)胞形態(tài)完整，呈多邊形貼壁生長，核染色質(zhì)結(jié)構(gòu)正常，胞膜完整，呈均勻綠色。丹皮酚處理48 h后，出現(xiàn)凋亡的著色改變：核染色質(zhì)濃縮，熒光致密，但胞膜完整，呈亮綠色并出現(xiàn)固縮狀或碎片狀。部分細(xì)胞出現(xiàn)晚期凋亡著色改變：核染色質(zhì)發(fā)生濃縮并且胞膜破損，呈橘紅色。見圖1。

對照組 丹皮酚處理48 h

2.3流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞凋亡數(shù) 以60 mg/L丹皮酚處理MCF-7細(xì)胞48 h后，凋亡百分?jǐn)?shù)達到31.92%，明顯高于對照組。見圖2。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果

2.4PI3K/Akt mRNA的表達結(jié)果 以60 mg/L丹皮酚處理MCF-7細(xì)胞48 h后，PI3K/Akt mRNA的表達比對照組明顯減少(P<0.05。見圖3。

圖3 PI3K/Akt mRNA的表達結(jié)果

3 討 論

研究表明，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中，PI3K/Akt出現(xiàn)過度激活，引起細(xì)胞的生長、增殖和轉(zhuǎn)移，并促使細(xì)胞產(chǎn)生耐藥〔2〕，當(dāng)PI3K/Akt信號通路被阻斷之后，高表達Akt的細(xì)胞生長就會受到抑制，并且開始凋亡〔3〕。因此，PI3K/Akt信號通路成為人們備受關(guān)注的分子治療的靶標(biāo)。

丹皮酚是牡丹皮中的小分子活性物質(zhì)，對多種腫瘤細(xì)胞的增殖具有抑制作用〔4,5〕。先前的研究證明丹皮酚能誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡，其機制與減少Bcl-2表達，增強Bax表達并活化半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)有關(guān)〔1,6,7〕，而是否與PI3K/Akt表達調(diào)節(jié)有關(guān)尚不清楚，因此本文進一步探討了丹皮酚作用于乳腺癌細(xì)胞的PI3K/Akt分子機制。結(jié)果表明，丹皮酚能抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖，細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)明顯的凋亡特征，作用于48 h后的凋亡百分?jǐn)?shù)達到31.92%，并減少了PI3K/Akt mRNA的表達。提示丹皮酚誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡與PI3K/Akt mRNA的表達減少密切相關(guān)。

PI3K/Akt通過磷酸化激活或抑制下游靶蛋白Bad、caspase 9、腫瘤壞死因子(NF-κB)、forkhead、mTOR、Par-4、p21等而介導(dǎo)胰島素、多種生長因子等誘發(fā)的腫瘤細(xì)胞生長，經(jīng)多種途徑促進細(xì)胞存活，是重要的抗凋亡調(diào)節(jié)因子，抗凋亡機制之一就是增強Bcl-2表達，減少 Bax的表達，使Bcl-2/Bax比值升高〔8〕。本實驗結(jié)果得出丹皮酚減少了PI3K/Akt mRNA的表達，可以推測，丹皮酚通過抑制PI3K/Akt mRNA水平，使PI3K/Akt蛋白表達減少，則抑制某些細(xì)胞內(nèi)信使的磷酸化或激活，減少抗凋亡信號傳遞至下游通道的效應(yīng)分子，從而使凋亡增加，細(xì)胞生長受到抑制。

4 參考文獻

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