survivin-siRNA重組腺病毒質(zhì)粒與結(jié)直腸癌細(xì)胞劑量和時(shí)間的相關(guān)性

李日恒 張愛民 宋艷敏 趙立華 李 娟 張 娜 張 濤 陳 治 吳建飛 謝天浩 安宇亮 程樹杰

(河北大學(xué)附屬醫(yī)院，河北 保定 071000)

結(jié)直腸癌發(fā)病是多基因、多因素共同參與的結(jié)果，其治療除了手術(shù)、放化療、中藥等方法外，人們也積極致力于研究其他治療方式，如基因治療，其理論基礎(chǔ)為癌基因與抑癌基因的失衡是導(dǎo)致腫瘤形成的重要原因。survivin是凋亡抑制蛋白家族(IAP)中的一員,在人的胚胎、胸腺、生殖腺、甲狀腺、神經(jīng)干細(xì)胞、結(jié)腸上皮細(xì)胞等正常組織少量存在，在多種惡性腫瘤組織中高表達(dá)，在人類正常分化的組織中不表達(dá)〔1～4〕。相關(guān)研究表明，survivin高表達(dá)的腫瘤預(yù)后差〔5～8〕。本研究通過RNA干擾(RNAi)技術(shù)將腫瘤相關(guān)基因survivin沉默，抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞，探討survivin-siRNA重組腺病毒質(zhì)粒最佳抑制濃度和時(shí)間。

1 材料和方法

1.1材料 已構(gòu)建成功的重組腺病毒質(zhì)粒pBAsi-survivin，人類結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW480(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤細(xì)胞庫(kù))培養(yǎng)基 RPMI1640，5%胎牛血清，0.25%胰酶(北京清大天一科技有限公司)。

1.2儀器 低溫高速離心機(jī)(湖南湘立科技儀器有限公司)，核酸電泳儀、電泳槽、垂直板電泳槽、電轉(zhuǎn)儀(北京六一儀器廠),紫外分光光度儀(上海精密儀器有限公司)。PCR儀(Thermo 北京科譽(yù)興業(yè)科技發(fā)展有限公司)，Trizol試劑，PrimerScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒，survivin引物和內(nèi)參GAPDH引物均由大連寶生物公司合成及提供。

凝膠成像系統(tǒng)(Biorad GelDoc XR 上海旦鼎國(guó)際貿(mào)易有限公司)，水平搖床(上海喬躍電子有限公司)。PVDF膜，封閉液,洗脫液、脫脂奶粉,一抗、酶標(biāo)二抗，顯色液，顯影定影液，蛋白提取液及相關(guān)抗體(碧云天生物研究所)。酶標(biāo)儀(BIO-RAD 上海普林斯頓生物科技發(fā)展有限公司)，DMSO、MTT液、96孔板(北京世紀(jì)奧利生物技術(shù)有限公司)。

1.3方法

1.3.1重組質(zhì)粒構(gòu)建及轉(zhuǎn)染濃度、時(shí)間 靶向survivin 基因寡核苷酸的設(shè)計(jì)參考shRNA 的設(shè)計(jì)策略，選擇survivin 基因(基因序號(hào)為NM_001168.2)，survivin-shRNA的有效序列 GGCTGGCTTCATCCACTGC (86-104) 上游引物:5′-GTGTCACTAGGCGGGAACAC-3′；下游引物5′-TTATTCCCATGCGACGGTATC-3′,重組載體命名為pBAsi-survivin。經(jīng)測(cè)序證實(shí)survivin重組腺病毒質(zhì)粒成功構(gòu)建。

將已經(jīng)構(gòu)建好的腺病毒由293T 細(xì)胞包裝制備完成后，檢測(cè)其病毒滴度，分別感染SW480細(xì)胞，將pBAsi-survivin 由腺病毒載體介導(dǎo)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。按濃度分別為50、100、150、200、250、300 nmol/L,6個(gè)濃度梯度轉(zhuǎn)染人類結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW480，在最適濃度下檢測(cè)轉(zhuǎn)染12、24、36、48、60、72 h 6個(gè)時(shí)間梯度。

1.3.2RT-PCR檢測(cè)survivin mRNA表達(dá)水平 按Trizol法提取細(xì)胞中的總RNA, 1%瓊脂糖凝膠電泳，110 V電壓，30 min。Gelred染色液染色，在紫外分光光度儀下進(jìn)行分析。按cDNA第一鏈試劑盒步驟合成cDNA, survivin上游引物:5′-CAGATTTGAATCGCGGGACCC-3′，下游引物：5′-CCAGAGTCTGGCTCGTTCTCAG-3′,產(chǎn)物長(zhǎng)度206 bp; 內(nèi)參GAPDH 上游引物:5′-GGAAGGTGAAGGTCGGAGT-3′，下游引物：5′-GACCACCTGGTGCTCAGTGT-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度295 bp。PCR擴(kuò)增條件：95℃ 30 s,95℃ 5 s，60℃ 1 min共30個(gè)循環(huán)，產(chǎn)物由PCR儀進(jìn)行定量分析〔9〕。

1.3.3Western印跡測(cè)定survivin蛋白情況 提取總蛋白，制備濃縮膠和分離膠，將蛋白經(jīng)電泳分離，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉1.5 h ，分別與1∶100稀釋的一抗 4℃孵育過夜，TTBS洗膜，1∶200稀釋的二抗孵育1.5 h, TTBS洗膜，以β-actin為內(nèi)參，化學(xué)發(fā)光 ，洗片，觀察survivin蛋白表達(dá)強(qiáng)度的變化〔10，11〕。

1.3.4MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)情況 用0.25%的胰酶制成單細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)入96孔板，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)68 h；加入10 μl MTT液/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液后，加入DMSO液，150 μl/孔，將培養(yǎng)板置于微孔板振蕩器上振蕩10 min，使結(jié)晶物溶解；用酶標(biāo)儀檢 測(cè)波長(zhǎng)570 nm處各孔OD值，測(cè)定細(xì)胞的凋亡率。

2 結(jié) 果

2.1轉(zhuǎn)染前后結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞鏡下情況，轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞逐漸融合，胞體數(shù)量減少，隨時(shí)間推移，細(xì)胞形態(tài)變成橢圓透亮型，見圖1。

轉(zhuǎn)染前 轉(zhuǎn)染后

2.2RT-PCR檢測(cè)survivin mRNA水平的變化 與空白對(duì)照組比較，濃度100、150、200、250、300 nmol/L時(shí)survivin mRNA的相對(duì)表達(dá)抑制率分別為39.01%、32.15%、26.43%、24.13%、23.32%，表明suvivin-siRNA重組腺病毒對(duì)survivin mRNA的最適濃度為100 nmol/L(P<0.05)。在濃度為100 nmol/L時(shí)，轉(zhuǎn)染時(shí)間在48 h時(shí)轉(zhuǎn)染效果最好，mRNA表達(dá)抑制率為67.19%，轉(zhuǎn)率時(shí)間在24、36、60、72 h時(shí)mRNA表達(dá)抑制率分別為42.14%、54.26%、56.79%、48.46%。

2.3Western印跡檢測(cè)survivin 蛋白的表達(dá) 濃度為100 nmol/L時(shí)survivin蛋白表達(dá)抑制率為47.83%，明顯高于其余濃度，50、150、200、250、300 nmol/L時(shí)蛋白抑制率分別為30.32%、39.15%、31.43%、29.23%、27.34%。轉(zhuǎn)染時(shí)間在48 h轉(zhuǎn)染效果最好，蛋白抑制率為68.24%，明顯高于其他轉(zhuǎn)染時(shí)間，12、24、36、60、72 h蛋白表達(dá)抑制率分別為24.54%、32.83%、49.15%、47.83%、35.34%。

2.4MTT法檢測(cè)處理后的結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡情況 suvivin-siRNA重組腺病毒在濃度為100 nmol/L時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率最高〔(15.1±1.0)%〕，50、150、200、250、300 nmol/L時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率分別為(7.2±0.8)、(14.3±0.9)、(12.2±1.2)、(11.2±0.7)、(9.4±0.6)%。48 h對(duì)人結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng)為(37.0±2.7)%，12、24、36、60、72 h生長(zhǎng)抑制率分別為(8.5±1.3)、(15.1±1.0)、(23.4±1.3)、(36.5±1.4)、(35.6±2.1)%。

3 討 論

腫瘤的發(fā)生是促凋亡與抗凋亡失衡的結(jié)果，抗凋亡的失衡是導(dǎo)致腫瘤形成的重要原因，survivin是目前發(fā)現(xiàn)分子量最小、作用最強(qiáng)的凋亡抑制因子，研究表明Survivin在結(jié)直腸癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、淋巴瘤、皮膚癌、前列腺癌、血管瘤等多種腫瘤組織中高度表達(dá)〔5〕，Survivin高度表達(dá)的腫瘤患者生存期明顯縮短〔5，7～9〕。結(jié)直腸癌是一種嚴(yán)重威脅人類生存的惡性腫瘤之一，采用以手術(shù)切除為主、放化療為輔的綜合治療。手術(shù)常難以清除微小病灶，放、化療仍有敏感性低、副作用大的缺點(diǎn)。研究表明survivin在結(jié)直腸癌中的總陽(yáng)性表達(dá)率為53.2%〔6〕。基于survivin在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)的特性，隨著目前RNA干擾技術(shù)的發(fā)展，通過RNA干擾技術(shù)沉默survivin用以達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的目的，其優(yōu)點(diǎn)是特異性強(qiáng)、副作用小。Yan等〔12〕構(gòu)建的腺病毒載體的siRNA用于轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞HepG2后，surivivin的mRNA和蛋白的表達(dá)明顯降低，細(xì)胞凋亡增加。Wen等〔13〕用RNAi技術(shù)將用沙門菌質(zhì)粒將survivin基因沉默的同時(shí)，并將GRIM-19表達(dá)，并轉(zhuǎn)染入喉癌裸鼠移植瘤中，能明顯抑制喉癌細(xì)胞的增殖，抑制率為53.4%。結(jié)合survivin沉默和GRIM-19的表達(dá)，喉癌移植瘤能達(dá)到消失的效果。張海霞等〔14〕利用脂質(zhì)體介導(dǎo)的survivin基因沉默作用于裸鼠人卵巢癌細(xì)胞，結(jié)果顯示survivin基因沉默可以促進(jìn)人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3細(xì)胞凋亡，進(jìn)而抑制裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)。

本研究結(jié)果顯示pBAsi-survivin濃度為100 nmol/L時(shí)是體外抑制結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞的最適宜濃度。轉(zhuǎn)染pBAsi-survivin 48 h后凋亡抑制作用最好。同時(shí)在濃度為100 nmol/L時(shí)轉(zhuǎn)染48 h后作用最明顯，隨著時(shí)間的遷移，細(xì)胞代謝產(chǎn)物增加會(huì)對(duì)pBAsi-survivin的抑制作用有影響。但這是否是最適宜的體內(nèi)抑制濃度，過高的濃度對(duì)體內(nèi)重要臟器的影響，還需要進(jìn)一步研究。

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