VEGF-C在宮頸癌細(xì)胞的表達(dá)及其與細(xì)胞黏附和侵襲的關(guān)系

田小飛，韓志紅，王 靜，劉愛蘭

(陜西省腫瘤醫(yī)院婦科，陜西 西安 710061)

血管內(nèi)皮生長因子-C (vascular endothelial growth growth factor-C,VEGF-C)是新近發(fā)現(xiàn)的特異性淋巴管生長因子，與腫瘤的淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)。VEGF-C對腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移的機制，是否也與腫瘤細(xì)胞的黏附、侵襲等轉(zhuǎn)移相關(guān)生物學(xué)行為的影響有關(guān)，目前相關(guān)研究報道很少。宮頸癌是婦科最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率在我國婦科惡性腫瘤中居首位。淋巴轉(zhuǎn)移是宮頸癌的重要轉(zhuǎn)移途徑，也是影響患者預(yù)后的重要因素。對宮頸癌淋巴轉(zhuǎn)移機制的研究，為靶向性阻斷宮頸癌淋巴轉(zhuǎn)移的可行性提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

Matrigel(Collaborative Research公司)，ECM膠E1270(Sigma公司)，纖維粘連蛋白FN(Roche公司)，反義VEGF-C寡核苷酸鏈：5’-CCCAGCCTTCCAGCTCCTTG-3’，兩端各3個堿基進(jìn)行硫代修飾，目標(biāo)核苷酸232～251，在5’端標(biāo)記FITC，隨機鏈序列為：5’-CAGCTCCTGTCCAGCCTCTC-3’，兩端各3個堿基進(jìn)行硫代修飾；陽離子脂質(zhì)體LipofectamineTM2000(Invitrogen公司，系尹如鐵副教授惠贈)；Transwell小室(3428型，孔徑8um，Corning-Costar公司),VEGF-C及內(nèi)參照GAPDH的引物均由華西醫(yī)院眼科實驗室協(xié)助設(shè)計，其氨基酸序列及其產(chǎn)物長度如下(見表1)。

表1 引物核苷酸序列及長度

2 方法

2.1 應(yīng)用脂質(zhì)體介導(dǎo)VEGF-C反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞

人宮頸癌HeLa細(xì)胞培養(yǎng)采用高糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基，含有10%的小牛血清，常規(guī)培養(yǎng)。將處于對數(shù)生長期HeLa細(xì)胞，將反義寡核苷酸鏈、正義鏈按終濃度為600 nmol/L分別用不含血清和抗生素的高糖DMEM培養(yǎng)基稀釋，將LipofectamineTM2000和寡核苷酸比例為2.5∶1比例混合，避光靜置20 min后轉(zhuǎn)染細(xì)胞，同時以未轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為對照組。首次轉(zhuǎn)染以5’端標(biāo)記FAM的反義寡核苷酸鏈進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染6 h后加入完全培養(yǎng)基，在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果，通過細(xì)胞內(nèi)熒光多少初步判斷轉(zhuǎn)染是否成功。

2.2 腫瘤細(xì)胞對細(xì)胞外基質(zhì)的黏附實驗

包被基底膜：配制以下3種溶液：10 g/L BSA；50 mg/L Matrigel 1∶2稀釋液；10 mg/L FN。水化基底膜：吸取培養(yǎng)板中的殘余液體，每孔加入50 ul含10 g/L BSA的無血清高糖DMEM培養(yǎng)液，孵育30 min后接種細(xì)胞：調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/ ml，分別將100 ul細(xì)胞懸液，接種到包被了BSA、Matrigel和FN的96孔板，每組平行6個樣本。MTT比色法檢測：測定各組細(xì)胞的光吸收值(OD值)，計算細(xì)胞黏附率。黏附率=(OD值實驗組-OD值BSA組)/OD值BSA組×100%

2.3 細(xì)胞體外侵襲力測定(按操作說明書進(jìn)行)

小鼠成纖維細(xì)胞系NIH3T3采用RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，待長勢良好時換無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后，收集上清液備用。200 ul/孔細(xì)胞外基質(zhì)包被Transwell小室底部。6孔板中加入培養(yǎng)基水化基底膜30 min。吸棄培養(yǎng)液，加入1∶1條件培養(yǎng)液和完全培養(yǎng)液2.5 ml于下室。接種轉(zhuǎn)染細(xì)胞2×105/孔于上室，培養(yǎng)24 h、48 h，每組設(shè)三個復(fù)孔。取出小室，用棉簽擦去上室中的細(xì)胞，酒精固定、蘇木素染色、伊紅再染色，梯度酒精脫水，取下膜，中性樹膠固定封片。在400倍光鏡下隨機取5個視野計數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，取其平均值代表侵襲力的值。

2.4 統(tǒng)計學(xué)處理

所有資料均用SPSS10.0軟件包進(jìn)行處理，采用t檢驗和方差分析進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，檢驗水準(zhǔn)定0.05，若P<0.05，認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 VEGF-C在宮頸癌HeLa細(xì)胞中的表達(dá)

實驗中采用陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染宮頸癌Hela細(xì)胞，免疫組化學(xué)檢測可見VEGF-G在細(xì)胞漿內(nèi)表達(dá)，以漿內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性(圖1)。熒光顯微鏡下顯示VEGF-C轉(zhuǎn)染效率>90%。

A VEGF-C在宮頸癌Hela細(xì)胞中的表達(dá)400× B FAM標(biāo)記的反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染6 h后Hela細(xì)胞400×

3.2 反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染前后HeLa細(xì)胞黏附能力的變化

從圖2可以看出，反義組的黏附率較對照組和正義組明顯降低，統(tǒng)計學(xué)處理差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。而對照組和正義組間也存在差異，但沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。各組細(xì)胞對兩種細(xì)胞外基質(zhì)的黏附能力也不同，經(jīng)方差分析，兩種基質(zhì)的黏附能力間存在的差異，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

A Hela細(xì)胞粘附實驗 B 反義寡核苷酸轉(zhuǎn)凍后Hela細(xì)胞粘附實驗

C 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞粘附率

3.3 寡核苷酸轉(zhuǎn)染前后HeLa細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell侵襲小室的多孔濾膜經(jīng)過HE染色，可以看到細(xì)胞質(zhì)呈粉紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)紫色，穿過微孔濾膜的細(xì)胞形態(tài)沒有變化。三組細(xì)胞的侵襲能力，通過計數(shù)穿過微孔濾膜的細(xì)胞數(shù)目來檢測，具體見下(圖3)。隨著作用時間延長，穿過重組基底膜的細(xì)胞數(shù)是增加的。在各組細(xì)胞的比較中，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，在各個時間點，反義組和對照組、正義組間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而對照組和正義間的差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見表2)。

A 未轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞穿膜48 h HE×400 B 反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染后Hela細(xì)胞穿膜48 h HE×400

表2 不同時間三組細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)

3 討論

3.1 VEGF-C在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)

1996年Joukou等[1]利用受體和色譜法，從人類的前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3的cDNA文庫中，克隆并分離出了VEGF家族的新成員VEGF-C。Ueda等[2]觀察16種婦科腫瘤細(xì)胞(鱗癌 SKG-I、SKG-II、SKG-IIIa、SKG-IIIb、OMC-1、YUMPTO、QG-U等，腺癌 HOKUG、NUZ、OMC-4、CAC-1等)的VEGF-C的表達(dá)和侵襲活性的關(guān)系；本實驗采用了免疫細(xì)胞化學(xué)法，直觀觀察到VEGF-C在宮頸癌HeLa細(xì)胞的強陽，宮頸癌HeLa細(xì)胞是腺癌細(xì)胞，有很強的侵襲和黏附能力。

3.2 VEGF-C反義寡核苷酸對細(xì)胞的黏附的影響

腫瘤細(xì)胞從母體脫離后，侵襲基底膜及細(xì)胞外基質(zhì)，使腫瘤擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移。已有研究證實了[3]，腫瘤細(xì)胞運動能力的強弱與其侵襲能力呈現(xiàn)正相關(guān)。腫瘤細(xì)胞只有與細(xì)胞外基質(zhì)成分粘連，才能實現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，阻斷腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附過程，可以影響腫瘤的轉(zhuǎn)移。本實驗中，檢測各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染了VEGF-C反義寡核苷酸，對細(xì)胞外基質(zhì)(FN)和Matrigel膠(富含層粘連蛋白LN)的黏附能力的改變，可以看到轉(zhuǎn)染了VEGF-C反義寡核苷酸的HeLa細(xì)胞組的黏附率明顯下降。這說明VEGF-C與細(xì)胞對周圍基質(zhì)的黏附能力有關(guān)。但具體調(diào)節(jié)機制還不清楚。曲明陽[4]等人將VEGF-C反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染入乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-435，細(xì)胞的黏附和侵襲能力下降，同時也下調(diào)了MMP-2蛋白的表達(dá)。MMP-2是基質(zhì)金屬蛋白酶家族的重要成員,在多種人類腫瘤中表達(dá)，通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞與基底膜的黏附及破壞由細(xì)胞間質(zhì)、基底膜組成的細(xì)胞外基質(zhì)屏障參與腫瘤的轉(zhuǎn)移。

3.3 VEGF-C反義寡核苷酸對細(xì)胞的侵襲的影響

體外侵襲的研究方法，人工基底膜實驗，現(xiàn)是國內(nèi)外應(yīng)用最廣泛的體外侵襲模型。Transwell侵襲小室的多孔聚碳酸酯濾膜上的孔徑是8ul,被基底膜ECM覆蓋后，腫瘤細(xì)胞不能自由穿過。腫瘤細(xì)胞在由小鼠成纖維細(xì)胞NIH3T3，制備的條件培養(yǎng)液的趨化和誘導(dǎo)下，可以穿過多孔濾膜。通過觀察穿過Transwell侵襲小室的多孔濾膜的細(xì)胞數(shù)目，了解細(xì)胞的侵襲能力。Stacker[5]等觀察到腫瘤細(xì)胞穿過重組基底膜的能力與其體內(nèi)侵襲能力，表現(xiàn)出較好的相關(guān)性，因而用來研究體外細(xì)胞的侵襲能力。本實驗采用Transwell侵襲小室方法，將ECM膠鋪在Transwell侵襲小室的多孔濾膜上，能形成與天然基底膜極為相似的基底膜結(jié)構(gòu)。ECM膠，是從小鼠的Engelbreth Holm-Swarm(EHS)sarcoma 中提取的基質(zhì)成分，含有LN、VI型膠原等。本實驗采用小鼠成纖維細(xì)胞NIH3T3，起到趨化，計數(shù)穿過濾膜的細(xì)胞數(shù)，觀察各組細(xì)胞的侵襲能力，轉(zhuǎn)染了VEGF-C反義寡核苷酸組的侵襲力是明顯受到抑制。

3.4 VEGF-C與腫瘤的轉(zhuǎn)移機制的關(guān)系

腫瘤轉(zhuǎn)移時受多因素影響和多基因調(diào)控，與腫瘤細(xì)胞自身的生物學(xué)特征、腫瘤細(xì)胞與周圍間質(zhì)間的相互作用有關(guān)。錯綜復(fù)雜的轉(zhuǎn)移過程，可能涉及到多種基因的相互協(xié)調(diào)、多基因產(chǎn)物的相互作用。VEGF-C促進(jìn)腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移的可能機制[6]：(1)腫瘤細(xì)胞分泌的VEGF-C與淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞VEGFR-3結(jié)合，VEGFR-3開始自身磷酸化，啟動淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，促進(jìn)腫瘤周圍毛細(xì)淋巴管的增生和擴(kuò)張，而淋巴管的數(shù)量與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況呈現(xiàn)正相關(guān)。增生的淋巴管沒有完整的基底膜，內(nèi)皮細(xì)胞間存在暫時裂隙，淋巴管的通透性增高，利于瘤細(xì)胞進(jìn)入。增生的淋巴管為腫瘤的生長提供了營養(yǎng)，同時增加了瘤細(xì)胞與淋巴管的接觸面積，使腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移的機會增加。(2)腫瘤細(xì)胞分泌的VEGF-C與自身的VEGFR-3的結(jié)合，使腫瘤細(xì)胞特異性的黏附到淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞上，導(dǎo)致轉(zhuǎn)移開始階段的發(fā)生。(3)VEGF-C作為一種趨化因子，使腫瘤細(xì)胞以淋巴管為靶向轉(zhuǎn)移，在一定程度上增加了腫瘤的特異器官的親和性；而且VEGF-C改變了淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附特性，也改變細(xì)胞因子、趨化因子的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移播散。VEGF-C激活淋巴內(nèi)皮，后者分泌某些細(xì)胞因子，對腫瘤細(xì)胞也產(chǎn)生趨化作用。(4)VEGF-C通過刺激內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生一氧化氮NO，調(diào)節(jié)淋巴管的收縮。(5)VEGF-C作用下，淋巴內(nèi)皮細(xì)胞局部釋放旁分泌因子，影響腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移相關(guān)生物學(xué)特性黏附、遷移、侵襲等，從而促進(jìn)轉(zhuǎn)移。(6)分泌VEGF-C并轉(zhuǎn)移到淋巴結(jié)的腫瘤細(xì)胞，由于能同時刺激淋巴管和血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，具有生長優(yōu)勢。

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