復(fù)方地黃方對帕金森病左旋多巴毒副反應(yīng)大鼠淋巴細(xì)胞表面多巴胺轉(zhuǎn)運體 mRNA表達(dá)的影響

羅瑞靜 何建成

(上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 201203)

帕金森病(PD)是一種由內(nèi)、外因素綜合作用導(dǎo)致的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，迄今其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明〔1〕。已有研究認(rèn)為其發(fā)生與免疫功能失調(diào)有關(guān)〔2〕，并證實PD患者淋巴細(xì)胞(PBL)表面多巴胺轉(zhuǎn)運體(DAT) mRNA表達(dá)較正常人明顯減少〔3〕，而其經(jīng)典治療藥物左旋多巴長期應(yīng)用亦可使DAT mRNA表達(dá)減少〔4〕。中藥復(fù)方地黃方對LD治療PD過程中的毒副反應(yīng)有明顯干預(yù)效果〔5，6〕，且可以通過增加中樞紋狀體內(nèi)DAT的數(shù)量來發(fā)揮干預(yù)作用〔7〕。本實驗研究LD大鼠PBL表面DAT表達(dá)的動態(tài)變化情況。

1 材料與方法

1.1動物及實驗條件 SD大鼠，雄性，6～8周齡，體重180～200 g，SPF級，110只，由上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。許可證號：SYXK(滬)2004-2005。實驗條件：動物飼養(yǎng)在上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，恒溫(23±2)℃，相對濕度60%～65%，自動光-暗控制(LD12:12，即07:00-19:00光照，19:00～07:00暗置)，動物攝食飲水及活動自由。

1.2藥物 戊巴比妥鈉：上海中西藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品(批號：WS20090920)；左旋多巴干粉：美國Sigma公司產(chǎn)品(批號：192K1885)；芐絲肼：美國Sigma公司產(chǎn)品(批號：BCBB8323)；慶大霉素：上海第一制藥廠產(chǎn)品，0.3 g/支(批號：H31021994)；復(fù)方地黃方：熟地黃15 g，白芍30 g，珍珠母15 g，丹參20 g，全蝎2 g等(濃度為5.18 g/ml)。由上海雷允上藥材有限公司代加工。

1.3主要試劑 6-羥基多巴胺(6-OHDA，批號：048K3728)，美國Sigma公司，阿撲嗎啡(APO，批號：057K1462)，美國Sigma公司，抗壞血酸(批號：063K1082)，美國Sigma公司，大鼠淋巴細(xì)胞分離液(批號：20100101)；上海微科生化試劑有限公司，PCR引物，上海生物工程有限公司，Trizol Reagent，美國Invitrogen公司，Oligo(dT)15，美國Promega公司，M-MuLV Reverse Transcriptase，美國Promega公司，2×Taq PCR Master Mix，上海萊楓生物科技有限公司，dNTPs mix，上海生物工程有限公司，核糖核酸酶抑制劑(RNAsin)，美國Promega公司，Spanish Agrose，上海華藍(lán)化學(xué)科技有限公司，100 bp DNA ladder，美國Amresco公司，焦碳酸二乙酯(DEPC)，美國Amresco公司。

1.4主要儀器 大鼠腦立體定位儀(TOW-3A型)，廣東汕頭市教育醫(yī)學(xué)儀器廠，微量進(jìn)樣器(5 μl)，上海第三分析儀器廠，分析天平(910324)，德國Sartorius公司，秒表(926266)，上海秒表廠，電動高速勻漿機(jī)，美國IKA Works公司，Du7500紫外分光光度計，德國Beckman公司，Heraeus低溫高速離心機(jī)，德國Heraeus公司，PCR儀(GeneAmp PCR System 9600)，美國Perkinelmer公司，Syngene生物圖像系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司，核酸電泳槽，美國Bio-Rad公司。

1.5模型制備方法 在經(jīng)典PD模型基礎(chǔ)上，進(jìn)一步腹腔注射LD，制備PD左旋多巴毒副反應(yīng)大鼠(LD大鼠)模型〔8～11〕。術(shù)前確認(rèn)無異常旋轉(zhuǎn)行為后，用3%的戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射麻醉。然后將大鼠固定于腦立體定位儀上，頭部去毛，苯扎溴銨(商品名：新潔爾滅)常規(guī)消毒。無菌條件下，沿正中線切開大鼠顱頂皮膚，剝離骨膜，暴露前囟。以前囟為準(zhǔn)，確定左側(cè)黑質(zhì)二坐標(biāo)：①前囟后5.2 mm，正中線右側(cè)1.0 mm，硬膜下9.0 mm。②前囟后5.2 mm，正中線右側(cè)2.5 mm，硬膜下8.5 mm。用顱骨鉆于手術(shù)要求部位小心鉆開顱骨，用5 μl微量進(jìn)樣器將6-OHDA(即將6-OHDA溶于含0.02%抗壞血栓的生理鹽水中，濃度為2 μg/μl)注入右側(cè)黑質(zhì)部(以1.0 mm/min速度緩慢進(jìn)針)，每孔3μL，注射速度為1 μl/min，注射完畢后留針5 min，然后以1.0 mm/min速度緩慢退針。手術(shù)完成后，用醫(yī)用明膠海綿填塞顱骨孔，縫合切口皮膚，肌肉注射慶大霉素7 d，待動物清醒后放回飼養(yǎng)籠中飼養(yǎng)。正常對照組只固定大鼠，不進(jìn)行任何處理，亦均為10 d。假手術(shù)組開顱后只注射含0.02%抗壞血栓的生理鹽水(濃度為2 μg/μl)。10 d后，以腹腔注射APO 0.5 mg/kg誘發(fā)大鼠向一側(cè)旋轉(zhuǎn)，記錄開始旋轉(zhuǎn)至30 min內(nèi)的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)，以旋轉(zhuǎn)圈數(shù)平均>7次/min者為合格的PD模型。將成功的PD模型大鼠給予腹腔注射左旋多巴/芐絲肼(50 mg/kg LD和12.5 mg/kg芐絲肼即LD和芐絲肼溶于含0.05%的乙醇和0.1%的抗壞血酸的注射用水中，配成10 mg/ml)，2次/d，連續(xù)2 w。正常對照組及假手術(shù)組給予腹腔注射等量的含0.05%的乙醇和0.1%的抗壞血酸的注射用水，2次/d。2 w后，再次以腹腔注射APO 0.5 mg/kg誘發(fā)大鼠向一側(cè)旋轉(zhuǎn)，記錄開始旋轉(zhuǎn)至30 min內(nèi)的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)，旋轉(zhuǎn)圈數(shù)較2 w前增加的為合格的LD模型大鼠〔11〕。

1.6分組及給藥

1.6.1分組方法 采用區(qū)層隨機(jī)法，將成功LD模型大鼠隨機(jī)分為兩組：LD模型組(左旋多巴)、復(fù)方地黃湯組(復(fù)方地黃湯+左旋多巴)，每組12只。另取正常對照組和假手術(shù)組，每組12只。然后再將各組分為4、6 w兩組，每組6只。

1.6.2給藥 LD模型組大鼠在腹腔注射左旋多巴/芐絲肼(50 mg/kg左旋多巴和12.5 mg/ml芐絲肼)的基礎(chǔ)上給予生理鹽水灌胃；復(fù)方地黃湯組大鼠在腹腔注射左旋多巴/芐絲肼的基礎(chǔ)上給予中藥灌胃；正常對照組及假手術(shù)組給予腹腔注射等量的含0.05%的乙醇和0.1%的抗壞血酸的注射用水的基礎(chǔ)上給予生理鹽水灌胃。每次灌胃量為2 ml，1次/d。

1.7大鼠血PBL分離 所有動物在處死前均從腹腔注射麻醉劑(水合氯醛10%，0.4 ml/100 g),待動物麻醉后，腹主動脈取血5 ml，置于肝素抗凝管中，用密度梯度離心法分離淋巴細(xì)胞。取新鮮抗凝血5 ml，與生理鹽水1∶1 混勻后，將其小心加于5 ml淋巴細(xì)胞分離液的液面上，以5 000 r/min離心(半徑15 cm水平轉(zhuǎn)子)15 min，此時離心管中由上至下細(xì)胞分四層：第一層為血漿或組織勻漿液層；第二層為環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞或單核細(xì)胞層；第三層為透明分離液層；第四層為紅細(xì)胞層。用吸管收集第二層于另一試管中，加入0.01 mol/L PBS10 ml(pH7.4)，3 000 r/min離心洗滌5 min×3次，棄去上清液,隨后放入-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.8RNA的抽提及RT-PCR

1.8.1RNA的提取 實驗所需物品的處理:所用玻璃器皿均經(jīng)160～180℃高溫干燥6 h以上,非耐高溫器皿經(jīng)0.1%DEPC浸泡后，經(jīng)高壓(20磅，15 min)處理滅活RNA，所用試劑均用DEPC水配制后高壓處理。①細(xì)胞解凍后,加入PBS 5 ml離心,3 000 r/min,5 min,棄上清，②加Trizol 1 ml,上下顛倒數(shù)次,室溫5 min，③加氯仿250 μl,用力振蕩約30 s,室溫靜置10 min，④2 000 r/min×15 min,4℃,上清液移入新管(含RNA)，⑤加500 μl異丙醇,上下顛倒數(shù)次,室溫靜置10 min，⑥12 000 r/min×10 min,4℃,棄上清，⑦加75%乙醇1 ml,振搖后離心,7 500 r/min×5 min,4℃，⑧加30 L DEPC水溶解,然后紫外分光光度計測定OD值,-70℃保存。

1.8.2反轉(zhuǎn)錄反應(yīng) DAT引物序列為：基因庫查找號:S76145，上游: 5′- GCT CTA CTT CAG CCT ATG GA-3′，下游: 5′- GTG GTG ATG ATT GCG TCT-3′，產(chǎn)物為: 300 bp；β-actin引物序列為:上游:5′- AAG CAG GAG TAT GAC GAG TCC G -3′，下游:5′- GCC TTC ATA CAT CTC AAG TTG G -3′ 產(chǎn)物為:550 bp，在0.2 ml無RNA的PCR管中依次加入以下試劑：Total RNA(1 g/μl) 3 μl；Oligo dT(15) (0.5 g/μl) 1 μl；DEPC (RNase-free)調(diào)體積至12.5 μl；70℃變性5 min，冰浴5 min；5×RT buffer 4 μl；10 mmol/L 4dNTP mix 2 μl；RNA sin(40 U/μl)0.5 μl；M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶(200 U/μl)1 μl；42℃，60 min；72℃，10 min；之后迅速在冰上冷卻5 min。

1.8.3PCR擴(kuò)增反應(yīng) 在0.2 ml PCR管中依次加入以下試劑：反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μl；2×Taq PCR Master Mix 25 μl；Sense/antisense primer 1 μl(each)；DEPC 21 μl；94℃ 1 min；30個循環(huán)，58℃ 1 min；72℃ 1 min；72℃ 10 min。

1.8.4DNA電泳鑒定及圖像分析 PCR產(chǎn)物5 μl上樣于2%瓊脂糖凝膠，電壓為100 V，進(jìn)行電泳。應(yīng)用凝膠圖像分析系統(tǒng)(Image Master Software)進(jìn)行條帶光密度分析，經(jīng)β-actin校正得到相對光密度值。

2 結(jié) 果

LD模型組、復(fù)方地黃方組在4、6 w時均明顯低于正常對照組及假手術(shù)組(P<0.001)；復(fù)方地黃方組分別在4、6 w時明顯高于LD模型組(P<0.001)。復(fù)方地黃方組DAT mRNA表達(dá)較LD模型組明顯增強(qiáng)，伴隨給藥時間延長，LD模型組表達(dá)有減少趨勢，而復(fù)方地黃方組有增加趨勢。正常對照組、假手術(shù)組及復(fù)方地黃方組不同時間點比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；LD模型組在6 w時明顯低于4 w時(P<0.01)。見表1，圖1。

表1 各組大鼠PBL中 DAT mRNA表達(dá)的比較

1.Marker；2.正常對照組；3.假手術(shù)組；4.LD模型組(4 w)；5.復(fù)方地黃方組(4 w)；6.LD模型組(6 w)；7.復(fù)方地黃方組(6 w)

3 討 論

已有研究表明，PD的發(fā)生是多因素綜合作用結(jié)果〔1〕，其中與機(jī)體免疫功能異常有密切關(guān)系〔2〕。PD患者PBL表面DAT表達(dá)異常已為大量實驗證實〔3，4，12，13〕,但其具體機(jī)制尚未闡明。而LD對PD外周血淋巴細(xì)胞膜表面DAT表達(dá)的影響尚無統(tǒng)一認(rèn)識，基于復(fù)方地黃方良好的干預(yù)效果，本次實驗以PBL表面DAT為觀察對象來探討其干預(yù)機(jī)制。

有研究表明〔3〕，PD患者外周血淋巴細(xì)胞DAT數(shù)量明顯低于正常人,但LD對其影響情況，已有研究結(jié)果并不一致，張璟等〔12〕研究顯示，LD治療對PD患者外周血淋巴細(xì)胞DAT數(shù)量沒有影響，而陳嬿等〔4〕研究顯示LD治療組較非LD治療組低。本次實驗研究結(jié)果與課題組前期對中樞紋狀體內(nèi)DAT研究結(jié)果基本一致〔7〕，提示DAT基因表達(dá)及數(shù)量異常與LD治療PD時毒副反應(yīng)發(fā)生存在一定關(guān)系，而復(fù)方地黃方則可以通過提高DAT表達(dá)增加其數(shù)量來發(fā)揮“減毒增效”作用。

復(fù)方地黃方中熟地黃補(bǔ)腎益精、固本培元，為君藥；珍珠母平肝潛陽，白芍養(yǎng)血濡筋、緩急止顫，共為臣藥；丹參養(yǎng)血活血化瘀，全蝎祛風(fēng)通絡(luò)、活血化痰，共為佐藥。諸藥合用，共奏滋腎補(bǔ)肝、平肝熄風(fēng)、化痰祛瘀之功。前期研究〔7〕證實該方可以增加DA含量，DAT表達(dá)及數(shù)量上調(diào)是否與DA含量增加有關(guān)，還是復(fù)方地黃方直接促進(jìn)了DAT表達(dá)及數(shù)量上調(diào)等具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

4 參考文獻(xiàn)

1關(guān) 婷,鮑遠(yuǎn)程,余元勛，等.帕金森病發(fā)病機(jī)制的研究〔J〕.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2009；18(34)：4300-2.

2張艷玲，蘇炳銀.帕金森病發(fā)病免疫機(jī)制的研究進(jìn)展〔J〕.實用老年醫(yī)學(xué),2009；23(2):150-2.

3潘天虹,劉昭平,張 玨，等.帕金森病患者的外周血淋巴細(xì)胞DAT功能檢測〔J〕.中國神經(jīng)免疫學(xué)和神經(jīng)病學(xué)雜志，2002；9(4):214-6.

4陳 嬿,蔣雨平,楊莉芹.帕金森病外周血淋巴細(xì)胞多巴胺轉(zhuǎn)運體表達(dá)的研究〔J〕.中國臨床神經(jīng)科學(xué)，2007；15(4):392-6.

5何建成,王振華,袁燦興，等.復(fù)方地黃方對帕金森病大鼠神經(jīng)行為學(xué)及氧化應(yīng)激的影響〔J〕.中國康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志，2009；24(7):590-2.

6王振華，何建成，張春燕.復(fù)方地黃方對帕金森病大鼠細(xì)胞凋亡的影響〔J〕.新中醫(yī),2010；42(4):86-8.

7Luo RJ,He JC.Effects of compound rehmannia formula on dopamine transporter content in the corpus striatum of parkinson′s disease rats treated with levodopa〔J〕.Neural Regeneration Res,2011；6(12):898-902.

8Ungerstedt U.6-Hydroxy-dopamine induced degeneration of Central Monoamine neurons〔J〕.Eur J Pharmacol，1968；5(1):107-10.

9包新民,舒思云.大鼠腦立體定位圖譜〔M〕.北京：人民衛(wèi)生出版社,1991:53.

10Carman LS, Gage FH, Shults CW.Partial lesion of the substantianigra: relation between extent of lesion and rotational behavior〔J〕.Brain Res，1991；553(2)：275-83.

11何建成，王文武，丁宏娟.50mg/ kg劑量左旋多巴對帕金森病大鼠神經(jīng)行為學(xué)和超微結(jié)構(gòu)的影響〔J〕.中國老年學(xué)雜志,2010；30(9):1209-12.

12張 璟，肖 勒,陳生弟，等.帕金森病患者血淋巴細(xì)胞多巴胺轉(zhuǎn)運蛋白功能與密度的研究〔J〕.診斷學(xué)理論與實踐,2004；3(2)：79-82.

13Pellicanol C，Buttarelli FR，Circella A,etal.Dopamine transporter immunoreactivity in peripheral blood lymphocytes discriminates Parkinson’s disease from essential tremor〔J〕.J Neural Transm,2007；114(7): 935-8.