阿托伐他汀對(duì)大鼠動(dòng)脈增齡性變化的影響

彭文杰 吳賽珠 龔 勛 馬 懿 阮云軍 湯 敏 鐘元林 湯 展

(南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院，廣東 廣州 510515)

血管衰老是人體衰老過程中的重要部分，在衰老過程中血管壁增厚、NO減少等形態(tài)學(xué)和分子學(xué)特性的改變使機(jī)體逐漸失去血管內(nèi)的平衡，繼而隨著衰老的進(jìn)展更容易出現(xiàn)心血管疾病〔1〕。他汀類藥物除了降脂以外，還有多種其他的心血管保護(hù)作用。本研究擬觀察阿托伐他汀對(duì)大鼠動(dòng)脈增齡變化的影響，探討阿托伐他汀在血管衰老過程中的作用及其心血管保護(hù)作用的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物與分組 雄性Wistar大鼠由南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)scxk(粵)2011-0015)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分3組，每組8只：(1)12月齡組：喂養(yǎng)基礎(chǔ)飼料；(2)18月齡組：自12月齡喂養(yǎng)基礎(chǔ)飼料至18個(gè)月；(3)阿托伐他汀組：自12月齡喂養(yǎng)基礎(chǔ)飼料中添加阿托伐他汀5 mg·kg-1·d-1〔2〕，每周按體重調(diào)整阿托伐他汀鈣劑量，飼養(yǎng)至18個(gè)月。

1.2標(biāo)本的制備 處死大鼠后取胸主動(dòng)脈約150 mg，在37℃的PBS緩沖液中將脂肪組織剝離干凈，加入40 mmol/L、pH7.2的磷酸鉀緩沖液1.5 ml，4℃冰水中勻漿，10 000 r/min離心10 min，取上清-80℃保存。采用BCA蛋白定量法測(cè)蛋白濃度。

1.3主要試劑 超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；內(nèi)皮型一氧化氮合成酶(eNOS)一抗購(gòu)自Cell Signaling 公司。

1.4SOD和MDA的檢測(cè) SOD采用Oyanagui的亞硝酸鹽形成法檢測(cè)；MDA采用硫代巴比妥酸法檢測(cè)。嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書操作。

1.5Western印跡法檢測(cè)eNOS的表達(dá) 各取100 μg蛋白煮沸5 min后8%(體積分?jǐn)?shù))SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，然后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(minipore)，5%脫脂奶粉的封閉液(pH7.5，Tris-Cl 10 mmol/L，NaCl 50 mmol/L，0.1% Tween-20)封閉2 h，加一抗(1∶1 000)4℃孵化過夜，其后用二抗孵育，洗去二抗后顯影。圖像分析儀(Image J軟件)定量測(cè)定雜交信號(hào)的吸光度，用面積×密度代表表達(dá)量，以18月齡組表達(dá)量為100%，其他各組值與18月齡組表達(dá)量的均值比較得出相對(duì)吸光度值。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠主動(dòng)脈中SOD活性及MDA含量比較 與12月齡組大鼠比較，18月齡組大鼠主動(dòng)脈中SOD的活性降低，MDA含量升高；與18月齡大鼠比較，阿托伐他汀組大鼠主動(dòng)脈中SOD的活性升高，MDA含量降低。見表1。

2.2各組大鼠主動(dòng)脈中eNOS蛋白的表達(dá) 與12月齡組大鼠比較，18月齡組大鼠主動(dòng)脈中eNOS的蛋白表達(dá)降低；與18月齡組大鼠比較，阿托伐他汀組大鼠eNOS蛋白表達(dá)升高。見表1，圖1。

表1 各組大鼠主動(dòng)脈中SOD活性、MDA含量、eNOS蛋白水平比較

圖1 Western印跡檢測(cè)各組大鼠主動(dòng)脈中eNOS蛋白表達(dá)

3 討 論

研究表明，增齡是心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，盡管增齡是一個(gè)不可避免的過程，但隨著人們對(duì)衰老的機(jī)制的認(rèn)識(shí)，發(fā)現(xiàn)血管增齡性的衰老過程也并非是一個(gè)不可改變的心血管危險(xiǎn)因素〔3，4〕。隨著血管衰老的進(jìn)展，血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生了改變，出現(xiàn)血管硬化和舒張功能受損〔5〕。

已有研究表明，隨著衰老的進(jìn)展，大鼠主動(dòng)脈氧化應(yīng)激和活性氧簇(ROS)增加〔6，7〕，過量產(chǎn)生的ROS會(huì)引起血管內(nèi)皮細(xì)胞功能異常，促進(jìn)冠狀動(dòng)脈疾病發(fā)生〔8〕。SOD是體內(nèi)一種重要的抗氧化劑，是生物體內(nèi)防御氧化損傷的一種重要的ROS清除劑保護(hù)細(xì)胞免受自由基的損傷。MDA是ROS作用于細(xì)胞膜中的多不飽和脂肪酸，引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物。MDA含量反映了機(jī)體受自由基攻擊的嚴(yán)重程度，可以作為評(píng)價(jià)機(jī)體氧化應(yīng)激程度的指標(biāo)。

本研究結(jié)果顯示，阿托伐他汀可以改善大鼠增齡過程中血管的抗氧化功能和對(duì)氧自由基的清除能力。血管衰老過程中伴隨了血管內(nèi)皮功能的異常及其引起的內(nèi)皮依賴的血管舒張功能受損〔9，10〕。eNOS主要表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞，它有維持血管張力、控制血壓、抗動(dòng)脈粥樣硬化和其他多種血管保護(hù)作用。eNOS是內(nèi)皮源性NO生成的關(guān)鍵酶，內(nèi)皮源性NO對(duì)維持內(nèi)皮細(xì)胞功能的正常起著重要的作用；此外，內(nèi)皮源性NO可以抑制血小板的積聚和在血管壁上的粘附，從而起到防止血栓形成的作用；內(nèi)皮源性NO還具有抗動(dòng)脈粥樣硬化作用，它可以抑制炎癥因子、活性氧簇等引起的細(xì)胞凋亡，可以抑制血管平滑肌細(xì)胞的過度增殖，這對(duì)減緩動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)一步進(jìn)展和纖維粥樣斑塊形成起了重要作用〔11〕。eNOS信號(hào)途徑的異常所致的內(nèi)皮源性NO減少則與人類血管性疾病密切相關(guān)，如心肌梗死、腦卒中、原發(fā)性高血壓及肺動(dòng)脈高壓〔12〕。

已有研究表明，在糖尿病模型大鼠中，阿托伐他汀可以維持正常的內(nèi)皮功能、減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)和增加eNOS表達(dá)〔13〕。本研究結(jié)果顯示，隨著增齡，大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞功能受損，而阿托伐他汀可以改善大鼠增齡過程中血管的內(nèi)皮細(xì)胞功能。

他汀類藥物除了降脂以外，還有多種其他的心血管保護(hù)作用，包括改善內(nèi)皮功能、穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊、減輕氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)等作用〔14，15〕。本實(shí)驗(yàn)研究表明，阿托伐他汀可以通過改善衰老過程中的血管抗氧化能力和增加eNOS蛋白表達(dá)，改善大鼠血管內(nèi)皮功能，從而延緩大鼠血管衰老的進(jìn)程，發(fā)揮心血管保護(hù)作用。

4 參考文獻(xiàn)

1Bachschmid MM，Schildknecht S,Matsui R,etal，Vascular aging：chronic oxidative stress and impairment of redox signaling-consequences for vascular homeostasis and disease〔J〕.Ann Med，2013；45(1)：p.17-36.

2Briones AM，Rodriguez-Criado N,Hernanz R,etal，Atorvastatin prevents angiotensin Ⅱ-induced vascular remodeling and oxidative stress〔J〕.Hypertension，2009；54(1)：142-9.

3Hayflick L.Biological aging is no longer an unsolved problem〔J〕.Ann N Y Acad Sci，2007；1100：1-13.

4Pepe S，Lakatta EG.Aging hearts and vessels：masters of adaptation and survival〔J〕.Cardiovasc Res，2005；66(2)：190-3.

5Seals DR，Moreau KL,Gate PE,etal.Modulatory influences on ageing of the vasculature in healthy humans〔J〕.Exp Gerontol，2006；41(5)：501-7.

6Ungvari Z，Bailey-Downs L,Sosnowska D,etal.Vascular oxidative stress in aging：a homeostatic failure due to dysregulation of NRF2-mediated antioxidant response〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2011；301(2)：H363-72.

7Marmol F，Sanchez J,Lopez D,etal.Loss of adaptation to oxidative stress as a mechanism for aortic damage in aging rats〔J〕.J Physiol Biochem，2007；63(3)：239-47.

8Ungvari Z，Kaley G,de Cabo R,etal.Mechanisms of vascular aging：new perspectives〔J〕.J Gerontol A Biol Sci Med Sci，2010；65(10)：1028-41.

9Yavuz BB，Yavuz B,Sener DD,etal.Advanced age is associated with endothelial dysfunction in healthy elderly subjects〔J〕.Gerontology，2008；54(3)：153-6.

10Donato AJ，Eskurza I,Silver AE,etal.Direct evidence of endothelial oxidative stress with aging in humans：relation to impaired endothelium-dependent dilation and upregulation of nuclear factor-kappa B〔J〕.Circ Res，2007；100(11)：1659-66.

11Forstermann U，Sessa WC.Nitric oxide synthases：regulation and function〔J〕.Eur Heart J，2012；33(7)：829-37，837a.

12Michel T.NO way to relax：the complexities of coupling nitric oxide synthase pathways in the heart〔J〕.Circulation，2010；121(4)：484-6.

13Wenzel P，Daiber A,Delze M,etal.Mechanisms underlying recoupling of eNOS by HMG-CoA reductase inhibition in a rat model of streptozotocin-induced diabetes mellitus〔J〕.Atherosclerosis，2008；198(1)：65-76.

14Liao JK，Laufs U.Pleiotropic effects of statins〔J〕.Ann Rev Pharmacol Toxicol，2005；45：89-118.

15Liao JK.Beyond lipid lowering：the role of statins in vascular protection〔J〕.Int J Cardiol，2002；86(1)：5-18.