DAPT通過(guò)抑制NOTCH信號(hào)通路對(duì)食管癌細(xì)胞株體外增殖的影響

許雙塔 許建華 鄭正榮 趙清泉

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院腫瘤科，福建 泉州 362000)

食管癌的發(fā)展一般經(jīng)過(guò)上皮不典型增生、原位癌、浸潤(rùn)癌等階段，與其他惡性腫瘤一樣，強(qiáng)調(diào)早期診斷和早期治療〔1〕。Notch信號(hào)是相鄰細(xì)胞之間通訊進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞發(fā)育的重要通路，γ-分泌酶是由4個(gè)亞單位組成的膜內(nèi)蛋白水解酶，主要參與β-淀粉樣蛋白前體(APP)和Notch等重要跨膜蛋白的切割和水解過(guò)程，γ-分泌酶滅活后，會(huì)影響Notch信號(hào)通路〔2〕。γ-分泌酶抑制劑(DAPT)(GSI-IX)是間接抑制γ-分泌酶底物Notch的活性，進(jìn)而影響細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞分化〔3〕。本研究通過(guò)觀察DAPT抑制NOTCH信號(hào)通路對(duì)食管癌細(xì)胞株HE-1體外增殖的影響，為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞株與主要試劑 DAPT、二甲基亞砜(DMSO，美國(guó)Sigma公司)，胎牛血清(美國(guó) GIBCO公司)，RPMI 1640培養(yǎng)基(美國(guó)Solarboi公司)，噻唑藍(lán)(MTT)粉、焦碳酸二乙酸(DEPC)(美國(guó)Amresco公司)，流式細(xì)胞儀(英國(guó)Stat公司，F(xiàn)ACSCalibur型)，全自動(dòng)酶標(biāo)儀Fax-2100 (英國(guó)Stat公司),RT-PCR試劑盒和Trizol試劑(美國(guó)Invitrogen公司)。HE-1細(xì)胞由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所提供。

1.2研究方法 條件：10%胎牛血清，RPMI 1640培養(yǎng)基，37℃、5% CO2于恒溫孵育箱內(nèi)培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HE-1細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HE-1細(xì)胞，用胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)消化，加入適量RPMI1640并進(jìn)行吹打，1 500 r/min離心5 min，棄上清液，加入全培養(yǎng)基，調(diào)整濃度后接種于96孔板。隨機(jī)分為四組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，細(xì)胞貼壁后實(shí)驗(yàn)組分別加入1、5、10 μmol/L的DAPT，對(duì)照組加入相應(yīng)的培養(yǎng)液。

1.3MTT法檢測(cè)HE-1細(xì)胞體外增殖活性 每組設(shè)4個(gè)平行樣，繼續(xù)培養(yǎng)0、24、48、72 h后分別加入MTT 20 μl，去培養(yǎng)液，加入DMSO 150 μl并置于振蕩器上震蕩混勻，用酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔吸光度值(D值)，抑制率=(實(shí)驗(yàn)組D值-對(duì)照組D值/對(duì)照組D值)×100%，4個(gè)平行率取平均值作為最終抑制率。

1.4Western 印跡檢測(cè)Notch2/hes1表達(dá)情況 總蛋白抽提試劑盒提取4個(gè)組的細(xì)胞蛋白。首先去除培養(yǎng)基，加磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2遍，吸盡PBS盡量不留1滴，在冰上加入裂解液(0.1 ml/孔)，吹打使其與細(xì)胞完全接觸，12 000 r/min離心5 min，取上清液，-20℃貯存。預(yù)備沸水，將凍存的蛋白取出置入沸水煮5 min，配分離膠、濃縮膠，然后微量加樣器上樣，中間每孔加20 μl marker，余孔加上樣液，配電泳液預(yù)冷，電泳(先80 V蛋白跑至分離膠再120 V跑完)，然后配電轉(zhuǎn)液，起膠，裁下所需大小的膠置有電轉(zhuǎn)液的培養(yǎng)皿中，根據(jù)膠的大小裁下聚編氯丙烯(PVDF)膜及濾紙(右上角標(biāo)記)，按濾紙、膠、PVDF膜、濾紙的順序疊好，75 V電轉(zhuǎn)5 h，配一抗，4℃孵育24 h，濾紙吸干，TBS洗膜，二抗反應(yīng)，Tris鹽酸緩沖液(TBS)洗膜，化學(xué)發(fā)光印證法(ECL)顯色，磷酸纖維素膜(NC)置于片夾中，曝光，顯影定影，圖像分析(采用Alpha軟件)。

2 結(jié) 果

2.1DAPT對(duì)食管癌HE-1細(xì)胞體外增值活性的影響 實(shí)驗(yàn)組3個(gè)濃度梯度的細(xì)胞增殖活性均有不同，DAPT濃度越高，HE-1細(xì)胞體外增值活性越低，DAPT對(duì)其抑制率越高。從時(shí)間順序看，DAPT作用時(shí)間越長(zhǎng)，HE-1細(xì)胞體外增殖活性越低，DAPT對(duì)其抑制率越高，高、中劑量組與低劑量組抑制率存在顯著差異(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2NOTCH信號(hào)通路中Notch2/hes1表達(dá)情況 實(shí)驗(yàn)組3個(gè)濃度梯度的細(xì)胞中NOTCH信號(hào)通路中Notch2/hes1表達(dá)不同，DAPT濃度越高，HE-1細(xì)胞NOTCH信號(hào)通路中Notch2/hes1表達(dá)水平越低，DAPT對(duì)其抑制率越高；從時(shí)間順序看，DAPT作用時(shí)間越長(zhǎng)，食管癌HE-1細(xì)胞NOTCH信號(hào)通路中Notch2/hes1表達(dá)水平也越低(P<0.05)。見(jiàn)表3。

2.3HE-1中HER4的核表情況 隨DAPT濃度增高，實(shí)驗(yàn)組3個(gè)濃度梯度的HE-1細(xì)胞中HER4表達(dá)水平呈順序降低，DAPT對(duì)其抑制率越高，從時(shí)間順序看，DAPT作用時(shí)間越長(zhǎng)，HE-1細(xì)胞中HER4核外水平也越低(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表1 DAPT對(duì)食管癌HE-1細(xì)胞體外增殖活性的影響〔n(%),n=4〕

表2 NOTCH信號(hào)通路中Notch2/hes1表達(dá)情況(n=4)

表3 食管癌細(xì)胞株HE-1中HER4的核表情況(n=4)

2.4DAPT濃度與HE-1細(xì)胞體外增殖活性的劑量效應(yīng)關(guān)系 實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖活性隨DAPT濃度的增高呈逐漸減低的趨勢(shì)，隨DAPT作用時(shí)間增長(zhǎng)，HE-1細(xì)胞體外增值活性被抑制的越明顯(r48=834，r72=0.910，P<0.05)，見(jiàn)圖1。

2.5DAPT濃度與信號(hào)通路的活化程度關(guān)系 實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中相關(guān)蛋白的表達(dá)灰度值隨DAPT濃度的增高呈逐漸減低的趨勢(shì)，DAPT作用時(shí)間越長(zhǎng)灰度值減低越明顯(r24=-0.612，r48=-0.748，r72=-0.875，P<0.05)，見(jiàn)圖2。

圖2 DAPT濃度與信號(hào)通路的活化程度的關(guān)系

3 討 論

Notch信號(hào)通路由Notch受體、Notch配體(DSL蛋白)、CSL (CBF-1，Suppressor of hairless，Lag的合稱)DNA結(jié)合蛋白、其他的效應(yīng)物和Notch的調(diào)節(jié)分子等組成〔4〕。Notch信號(hào)的產(chǎn)生是通過(guò)相鄰細(xì)胞的Notch配體與受體相互作用，Notch蛋白經(jīng)過(guò)3次剪切，由胞內(nèi)段(NICD)釋放入胞質(zhì)，并進(jìn)入細(xì)胞核與轉(zhuǎn)錄因子CSL結(jié)合,形成NICD/CSL轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合體，從而激活HES、HEY、HER等堿性-螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄抑制因子家族的靶基因，發(fā)揮生物學(xué)作用〔5〕。

前期研究表明食管癌細(xì)胞中，細(xì)胞核內(nèi)有HER4表前期研究表明食管癌細(xì)胞中、細(xì)胞核內(nèi)有HER4表達(dá)〔6〕。Notch信號(hào)是相鄰細(xì)胞之間通訊進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞發(fā)育的重要通路。γ-分泌酶是由4個(gè)亞單位組成的膜內(nèi)蛋白水解酶，主要參與APP和Notch等重要跨膜蛋白的切割和水解過(guò)程〔7〕。研究發(fā)現(xiàn)〔8〕，小鼠皮膚γ-分泌酶滅活后，會(huì)影響Notch信號(hào)通路，從而引起與反常性痤瘡患者病變皮膚相似的組織病理改變。DAPT阻止了Notch信號(hào)通路的活化，通過(guò)抑制Notch2/hes1等相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)對(duì)其發(fā)揮抑制作用，進(jìn)而對(duì)細(xì)胞增殖產(chǎn)生影響。

食管癌系指由食管鱗狀上皮或腺上皮的異常增生所形成的惡性病變，Notch信號(hào)通路在腫瘤細(xì)胞之間起通訊作用，對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖有重要作用。本研究結(jié)果提示DAPT可能通過(guò)干擾γ-分泌酶，進(jìn)而影響NOTCH信號(hào)通路中相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)，進(jìn)而通過(guò)抑制通路活性對(duì)細(xì)胞增殖活性起到抑制作用。

4 參考文獻(xiàn)

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