高脂喂養(yǎng)的胰島素抵抗大鼠骨骼肌蛋白激酶B mRNA表達(dá)的改變

劉 晶 李彩英 宋光耀

(河北省人民醫(yī)院內(nèi)分泌二科，河北 石家莊 050000)

胰島素抵抗(IR)是2型糖尿病最主要的病理生理機(jī)制之一。骨骼肌處理體內(nèi)超過70%的葡萄糖,其葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)和利用,需要胰島素的介導(dǎo)。蛋白激酶B(PKB)表達(dá)和(或)活性改變可能在IR的形成和發(fā)展中起重要作用。本研究檢測(cè)大鼠骨骼肌中胰島素誘導(dǎo)的PKB mRNA的表達(dá)的改變。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 70只雄性Wistar大鼠，體重250～280 g，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，每籠2只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后按體重隨機(jī)分為正常對(duì)照組(n=20)，高脂飲食組(n=15)。正常對(duì)照組給予基礎(chǔ)飼料(熱量組成:碳水化合物占65.5%，脂肪占10.3%，蛋白質(zhì)占24.2%)，高脂飲食組喂以高脂飼料(熱量組成:脂肪59.8%，碳水化合物20.1%，蛋白質(zhì)20.1%)，所有飼料均由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。兩組每日等熱量投喂飼料，每周稱體重1次。高脂喂養(yǎng)4 w，經(jīng)高胰島素-正葡萄糖鉗夾實(shí)驗(yàn)證實(shí)高脂喂養(yǎng)組IR形成。

1.2高胰島素—正葡萄糖鉗夾試驗(yàn)〔1〕在麻醉狀態(tài)下行大鼠頸動(dòng)脈及頸靜脈插管，導(dǎo)管經(jīng)皮下從頸后引出，100 U/ml肝素封管，結(jié)扎后固定于頸后皮膚。大鼠清醒后單籠飼養(yǎng)，自由采食飲水。4～5 d后，待大鼠恢復(fù)插管前體重，禁食12 h過夜，次晨在特制的鼠籠中行清醒狀態(tài)下高胰島素-正葡萄糖鉗夾試驗(yàn)。平衡10 min后，自頸動(dòng)脈導(dǎo)管取血分離血清測(cè)定基礎(chǔ)胰島素，并在其遠(yuǎn)端接一支裝有50 U/ml肝素生理鹽水的注射器，避免凝血，保證取血順利。頸靜脈導(dǎo)管通過一個(gè)三通接雙通道微量輸液泵，一個(gè)通道內(nèi)裝有濃度為40 mU/ml胰島素(基因工程人胰島素，丹麥諾和諾德公司產(chǎn)品)，另一通道內(nèi)為30%的葡萄糖?；A(chǔ)血糖穩(wěn)定后在大鼠清醒狀態(tài)下以4 mU·kg-1·min-1的固定速率輸注胰島素。每5 min測(cè)血糖一次，如低于基礎(chǔ)值則開始按9～14 mg·kg-1·min-1的速率輸注30%葡萄糖，并在隨后的鉗夾過程中每10 min測(cè)定血糖一次，根據(jù)血糖值調(diào)整葡萄糖輸注速度，使大鼠血糖保持在實(shí)驗(yàn)前空腹血糖(FBG)±0.5 mmol/L的范圍內(nèi)，連續(xù)5次以上血糖在上述范圍說明達(dá)到穩(wěn)態(tài)。記錄穩(wěn)態(tài)下5～6次葡萄糖輸注速率(GIR)的平均值作為大鼠胰島素的敏感性的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

1.3RT-PCR測(cè)定PKB mRNA水平 采用ABI 7300測(cè)定PKB mRNA水平。用Trizol試劑提取骨骼肌總RNA,行完整性和純度鑒定,并依OD260值進(jìn)行定量。采用Prmier express2.0軟件設(shè)計(jì)引物,序列如下:上游引物,5′-TCTACGGTGCG-GAGATTGTG-3′;下游引物,5′-CCCGGTACACCACGTTCT-TC-3′。引物濃度20 μmol/L,常規(guī)方法反轉(zhuǎn)錄。RT-PCR體系:5×SYBRGreen 緩沖液10 μl上游引物0.5 μl，下游引物0.5 μl，25 mmol/L dNTPs 0.5 μl，2 U/μl Taq酶1.5 μl，cDNA模板5 μl，雙蒸水(ddH2O)32 μl。條件:93℃ 3 min,1個(gè)循環(huán);93℃ 1 min,55℃ 1 min,72℃ 1 min,40個(gè)循環(huán),于每循環(huán)延伸反應(yīng)最后時(shí)刻收集熒光信號(hào)。

1.4其他指標(biāo)測(cè)定方法 空腹胰島素(FINS)的測(cè)定用放射免疫法(藥盒購自中國原子能科學(xué)研究院同位素研究所)；血糖測(cè)定采用Roche公司羅康優(yōu)越牌血糖測(cè)定儀。

2 結(jié) 果

2.1實(shí)驗(yàn)第4周大鼠FPG、FINS及GIR情況 與正常對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)第4周時(shí)，高脂飲食組大鼠FPG及FINS明顯升高(P<0.05)；高脂組大鼠GIR顯著低于正常對(duì)照組(P<0.01)。見表1。

2.2骨骼肌PKB mRNA的表達(dá) 與正常對(duì)照組(5.721 25±1.077 08)相比高脂組(3.122 36±1.004 979)PKB mRNA表達(dá)明顯減弱(P<0.05)。

表1 高脂喂養(yǎng)4 w大鼠FPG、FINS及

3 討 論

高脂飲食在IR的誘發(fā)中可能起到重要作用，其機(jī)制可能是飲食引起血漿甘油三酯和游離脂肪酸水平增高，后者通過糖脂肪酸循環(huán)、胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多個(gè)不同途徑抑制糖儲(chǔ)存，降低胰島素敏感性，而導(dǎo)致胰島素抵抗的發(fā)生〔1〕。應(yīng)用高脂喂養(yǎng)大鼠誘導(dǎo)產(chǎn)生的IR鼠模型是研究胰島素和糖尿病的理想模型〔2〕。與前期研究發(fā)現(xiàn)相同〔3，4〕，本研究表明高脂飼料喂養(yǎng)的大鼠存在高胰島素血癥，胰島素敏感性明顯降低，即IR形成。

IR是指外周組織和靶器官對(duì)內(nèi)和(或)外源性胰島素的敏感性和反應(yīng)性降低的一種代謝狀態(tài)。任何環(huán)節(jié)受到干擾，均會(huì)影響胰島素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。PI3K/Akt信號(hào)通路是胰島素的主要信號(hào)通路。PI3K-Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路的阻滯是外周組織IR及2 型糖尿病發(fā)生的最基本機(jī)制之一〔5〕。PKB是這一途徑中重要的絲氨酸/蘇氨酸激酶,是胰島素刺激葡萄糖攝取和GLUT4轉(zhuǎn)位所必需的信號(hào)分子,對(duì)胰島素代謝、激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)起重要作用。國外研究表明〔6〕，IR大鼠PKB 蛋白質(zhì)表達(dá)減少，表現(xiàn)出明顯的胰島素介導(dǎo)的葡萄糖攝取缺陷,同時(shí)表達(dá)出類似于人類2型糖尿病的跡象。在高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖大鼠〔7〕，肝臟細(xì)胞中的炎性因子如腫瘤壞死因子α，白細(xì)胞介素-6表達(dá)上調(diào)，抑制肝臟細(xì)胞中PKB等信號(hào)蛋白表達(dá)，介導(dǎo)肝臟細(xì)胞IR。本研究也表明，銀杏葉提取物〔3〕通過上調(diào)調(diào)骨骼肌PKB蛋白及mRNA表達(dá),從而可能對(duì)胰島素信號(hào)通路產(chǎn)生影響,改善胰島素敏感性。羅格列酮〔4〕也通過上調(diào)高脂飲食老年大鼠骨骼肌GLUT4和PKB的表達(dá),改善IR。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)，高脂喂養(yǎng)的IR骨骼肌中PKB表達(dá)明顯降低，削弱胰島素的降糖作用,可能是IR產(chǎn)生的原因之一，為糖尿病的治療提供新的思路，但其詳細(xì)機(jī)制，還需進(jìn)一步深入的研究。

4 參考文獻(xiàn)

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