破血化瘀，填精補髓方劑對腦出血大鼠腦血腫周圍組織生長因子的表達

任吉祥 畢鐵琳 周翔宇 王海燕

(長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院， 吉林 長春 130021)

腦出血(ICH)是具有病死率、致殘率高，并發(fā)癥多等特點，已發(fā)展成為危害人類健康的主要疾病之一〔1〕。雖然ICH后神經(jīng)細胞凋亡的啟動機制尚不十分清楚，但大量研究發(fā)現(xiàn)誘導ICH后細胞凋亡的因素很多，如缺血導致的自由基瀑布效應〔2〕，炎性反應，其細胞因子的分泌表達，凝血酶的作用等〔3〕。中醫(yī)藥在治療腦卒中恢復期神經(jīng)功能恢復、重建等方面具有毒副作用小，療效確切等優(yōu)點〔4〕。在“髓虛毒損”的腦病發(fā)病病機關(guān)鍵指導下，將出血性腦卒中“破血化瘀，豁痰開竅，泄熱醒神”的治療大法進一步創(chuàng)新，提出了“破血化瘀，填精補髓”治療總則。由水蛭、生大黃、生蒲黃、虻蟲、瓜蔞、三七、石菖蒲、龜板膠等組成“破血化瘀，填精補髓”中藥湯劑是作者所在研究團隊在長期臨床實踐中總結(jié)出來的重要方劑，能有效改善腦出血患者的臨床癥狀，提高患者的日常生活能力〔5〕。實驗擬以醒腦健神膠囊為藥性對照藥物，觀察破血化瘀，填精補髓方劑對急性期ICH大鼠腦組織中腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、酪氨酸激酶 B(TrKB)及血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達的影響，進一步探討ICH后大鼠神經(jīng)元的保護性作用及其可能的機制。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1動物 清潔級Wistar大鼠150只，鼠齡8 w，雌雄不限，體質(zhì)量150～160 g，由吉林大學實驗動物中心提供，動物許可證號：SCXK(吉)2011-0063。動物分籠飼養(yǎng)，室溫維持在20℃～25℃，濕度40%～70%，光照條帶強度15～20Lux，大鼠自由飲水和攝食。實驗中對動物的操作符合科技部2006年頒布的《關(guān)于善待實驗動物指導性意見》。

1.1.2藥物 破血化瘀，填精補髓法實驗方劑由水蛭(山東，水蛭全體呈圓柱形)8 g、生大黃10 g(青海，莖紅色)、生蒲黃15 g(江蘇，黃色粉末)、虻蟲5 g(江蘇，形似蜜蜂，體中等，黃綠色)、瓜蔞20 g(安徽，果實近球形，熟時橙紅色，光滑)、三七10 g(云南，光滑無毛，綠色或帶多數(shù)紫色細縱條紋)、石菖蒲15 g(杭州，其根莖具氣味，葉全緣，排成二列)、龜板膠10 g(河南，四方形的扁塊，褐色略帶微綠)組成，采用傳統(tǒng)煎藥法取適量藥材置于砂鍋中，加水浸泡3 min，煮沸，冷卻，過濾去渣后取藥液進行濃縮，使1 ml藥液中含生藥1 g，4℃保存?zhèn)溆?。醒腦健神膠囊(批號：111216)，主要由牛黃、郁金、菖蒲、膽南星、虻蟲、川芎組方)，由吉林省中醫(yī)院制劑室制備。

1.2方法

1.2.1實驗動物分組 將ICH模型成功大鼠120只，隨機分成五組：模型組，高、中、低劑量組，陽性藥組，每組24只；另設(shè)假手術(shù)組各24只；每組分為四個時間點，分別為(1、3、7、14 d)，每個時間點為6只。

1.2.2大鼠ICH模型的建立 參照文獻〔6,7〕報道的方法，大鼠以10%水合氯醛腹腔麻醉(350 mg/kg)，固定于大腦立體定位儀上，于前囟前0.2 mm中線向左側(cè)旁3 mm處鉆一直徑約為1 mm的小孔，斷尾取血，用微量注射器沿鉆孔方向?qū)?0 μl的抗凝血緩慢注入左側(cè)尾狀核，留針10 min，之后緩慢退針，縫合頭皮。假手術(shù)組不注射自體血。大鼠出現(xiàn)明顯的神經(jīng)系統(tǒng)病理體征，左側(cè)肢體失用性偏癱癥狀出現(xiàn)，以前肢為重，行走過程呈順時針向追尾狀，則為制備成功ICH模型〔8〕。

1.2.3中醫(yī)治療 高、中、低劑量藥物治療組大鼠分別以5、10、20 g/kg破血化瘀，填精補髓方劑灌胃治療，1次/d。陽性藥組大鼠以0.3 g/kg醒腦健神膠囊灌胃治療，1次/d。假手術(shù)組及模型組大鼠以10 ml/kg生理鹽水灌胃。對照組大鼠自由飲食飲水。

1.2.4神經(jīng)功能評價 造模后1、3、7，14 d，使用Longa等〔9〕評分法評定大鼠神經(jīng)功能。0 分：沒有神經(jīng)功能缺損；1 分：左側(cè)前爪不能完全伸展；2 分：行走時，大鼠向左側(cè)轉(zhuǎn)圈；3 分：行走時，大鼠身體向左側(cè)(癱瘓側(cè))傾倒；4 分：不能自發(fā)行走，有意識喪失。

1.2.5取材 造模后1，3，7及14 d，分別以10%水合氯醛過量麻醉大鼠，迅速斷頭開顱取腦，在冰盤上的培養(yǎng)皿(經(jīng)DEPC處理)上分離右側(cè)腦組織，以注血針孔處為中心取腦組織約100 mg，置于凍存管，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6大鼠腦水腫的測量 造模后3、7 d，把大鼠斷頭處死，取大腦，冠狀位切片，切成2 mm厚，用數(shù)碼相機拍照。使用病理圖像分析軟件(Image-Pro Plus)以冠狀位血腫最大切面與相應冠狀切面的面積比作為腦水腫的指標。

1.2.7大鼠大腦含水量的測定 采用干濕法測定大鼠大腦含水量。取大鼠2 mm厚冠狀位腦片，精確稱取腦組織濕質(zhì)量，置于100℃～110℃的烤箱中烘烤24 h至恒重后，稱取干質(zhì)量，腦組織含水量(%)=(濕質(zhì)量-干質(zhì)量)/濕質(zhì)量×100%〔10〕。

1.2.8反轉(zhuǎn)錄PCR檢測大鼠大腦黑質(zhì)豆狀核中BDNF及其受體TrkB mRNA的表達水平 取大鼠大腦黑質(zhì)組織100 mg置于DEPC水處理過的玻璃勻漿器中，加Trizol(Invitrogen，Carlsbad，USA)1 ml充分勻漿，室溫放置5 min；將組織勻漿轉(zhuǎn)移至EP管中，4℃下，12 000 r/min離心10 min；將上清液轉(zhuǎn)移至另一EP管中，每管加氯仿0.2 ml，室溫靜止2～3 min后，4℃，12 000 r/min離心15 min；將無色上層水相，轉(zhuǎn)移至另一潔凈的EP管中，加入等體積的異丙醇，上下輕輕搖勻，室溫下靜止10 min。4℃，12 000 r/min離心10 min；棄去上清液，每管加入75%冰乙醇1 ml，4℃，7 500 r/min離心5 min。去除上清液，室溫下干燥沉淀3～5 min，加入0.2 ml無RNase水溶解沉淀，制成組織總RNA溶液。RNA保存于50 μl無RNase滅菌用水中，-80℃保存。經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，應用紫外分光光度計(上海元析儀器有限公司)測定RNA，A260 nm/A280 nm比值在1.8～2.0，表明RNA的純度高，可用于反轉(zhuǎn)錄PCR實驗。引物由北京奧科生物技術(shù)有限責任公司合成。取0.2 ml PCR反應管，每管依次加入cDNA溶液2 μl，10×Taq酶緩沖液5 μl，dNTPs(10 mmol/L)2 μl，目的基因上、下游引物各10 μl，內(nèi)參上、下游引物各5 μl，cDNA溶液5 μl，Taq酶3 μl，DEPC處理水3 μl，總反應體積50 μl。BDNF上游：GTC CAC GGA CAA GGC AAC TTG G;下游：ACC GGA CAT GTC CAC TGC AGT;擴增長度392 bp；TrkB上游：GAT GTT CCA GCC ACT GTGAAC C;下游：CCC AAG ACC AGC AAGCAT AAG C;擴增長度257 bp;GAPDH上游：ACCACAGTCCATGCCATCAC;下游：TCCACCACCCTGTTGCTGTA;擴增長度450 bp;GAPDH預變性94℃ 5 min,變性94℃ 30 s，退火55℃ 30 s，延伸72℃ 1 min，后延伸72℃ 10 min，循環(huán)次數(shù)35；BDNF預變性94℃ 5 min，變性94℃ 1 min，退火58℃ 1 min，延伸72℃ 2 min，后延伸72℃ 10 min，循環(huán)次數(shù)35；TrkB預變性94℃ 5 min，變性94℃ 1 min，退火56℃ 1 min，延伸72℃ 2 min，后延伸72℃ 10 min，循環(huán)次數(shù)35。采用常規(guī)方法，用TAE緩沖液，制備含溴乙啶(終濃度為1 μg/μl)的1.5%瓊脂糖，每道加樣10 μl，室溫下100V恒壓電泳25 min。電泳結(jié)束后，取5 μl反應產(chǎn)物做2%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠圖像分析儀(杭州天能生物科技有限公司)采集圖像，用凝膠成像分析系統(tǒng)分析平均吸光度值。

1.2.9免疫組織化學染色觀察大鼠腦組織中的表達 將10%甲醛固定的大鼠腦采用常規(guī)石蠟包埋、切片，制成2 mm切片，分別進行蘇木素-伊紅(HE)染色。大鼠腦組織切片以二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化，枸櫞酸緩沖液熱修復 30 min，室溫自然冷卻；3% H2O2室溫孵育5 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗5 min×3次；滴加一抗(1∶50～200)4℃過夜，PBS沖洗，5 min×3；滴加通用型IgG抗體-辣根過氧化物酶(HRP)(即用型)37℃孵育15 min，PBS 5 min×3；應用二氨聯(lián)苯氨(DAB)溶液顯色，蒸餾水沖洗、HE復染、充分水洗、酸乙醇分化、充分水洗、乙醇脫水、二甲苯透明、樹脂膠封片。陰性對照不加一抗。高倍鏡下觀察細胞染色情況，拍照記錄結(jié)果。應用圖像分析方法(motic image advanced 3.2，北京儀嘉林科技有限公司)測定灰度值。

2 結(jié) 果

2.1破血化瘀，填精補髓方劑改善ICH大鼠神經(jīng)系統(tǒng)體征及神經(jīng)功能 與假手術(shù)組相比，ICH大鼠出現(xiàn)明顯的神經(jīng)系統(tǒng)病理體征，右側(cè)腦損傷后，左側(cè)肢體失用的偏癱癥狀，以前肢為重，行走過程呈順時針方向追尾狀，大鼠神經(jīng)功能缺損評分明顯增加(P<0.01)；與模型組大鼠比較，以不同劑量破血化瘀，填精補髓方劑或醒腦健神膠囊治療的大鼠上述癥狀明顯改善(P<0.01)，至第7天時，受試藥中、高劑量組大鼠神經(jīng)系統(tǒng)體征基本恢復正常。見表1。

表1 破血化瘀，填精補髓法對腦出血大鼠神經(jīng)功能缺損評分的影響

2.2破血化瘀，填精補髓方劑減少ICH大鼠吸收出血面積比 在連續(xù)給藥3 d后，陽性藥組與模型組大鼠比較，ICH面積比無顯著性差異(P>0.05)；受試藥低、中、高劑量組與模型組大鼠比較，ICH面積比均有顯著性差異(均P<0.05)；在連續(xù)給藥第7天后，受試藥三個劑量組與模型組大鼠比較ICH面積比均有顯著性差異(均P<0.01)，并表現(xiàn)出具有一定的時-量依賴關(guān)系。見表2。

2.3破血化瘀，填精補髓方劑減少ICH大鼠腦組織含水量 干濕法測定結(jié)果顯示，與假手術(shù)組大鼠比較，造模3 d后，模型組大鼠損傷腦區(qū)腦含水量明顯增加(P<0.01)。與模型組大鼠比較，造模3 d后陽性藥組及受試藥低、中、高劑量組大鼠腦含水量明顯降低(P<0.05)；但造模后7 d時各組大鼠腦含水量沒有顯著性差異(P>0.05)。見表3。

2.4破血化瘀，填精補髓方劑增加ICH大鼠血腫周圍組織BDNF，TrkB和VEGF表達 免疫組化染色顯示，與假手術(shù)組大鼠相比，ICH大鼠血腫周圍組織BDNF表達增加(P<0.05)；經(jīng)不同劑量破血化瘀，填精補髓方劑或醒腦健神膠囊治療的大鼠血腫周圍組織BDNF表達進一步增加(P<0.05)。見表4。

表2 破血化瘀，填精補髓法對各組大鼠出血面積比隨時間變化的比較

表3 破血化瘀，填精補髓方劑對ICH大鼠腦組織含水量的影響

表4 破血化瘀，填精補髓法對ICH大鼠腦血腫周圍組織BDNF表達(灰度值)的影響

免疫組化染色顯示，與假手術(shù)組大鼠相比，ICH大鼠血腫周圍組織TrkB表達增加(P<0.05)，而經(jīng)不同劑量破血化瘀，填精補髓方劑或醒腦健神膠囊治療的大鼠血腫周圍組織，TrkB表達進一步增加(P<0.05)。見表5。

免疫組化染色顯示，與假手術(shù)組大鼠相比，ICH大鼠血腫周圍組織VEGF表達增加(P<0.05);而經(jīng)不同劑量破血化瘀，填精補髓方劑或醒腦健神膠囊治療的大鼠血腫周圍組織VEGF表達進一步增加(P<0.05)。見表6。

表5 破血化瘀，填精補髓法對ICH大鼠腦血腫周圍組織TrkB表達(灰度值)的影響

表6 破血化瘀，填精補髓法對ICH大鼠腦血腫周圍組織VEGF表達(灰度值)的影響

2.5破血化瘀，填精補髓方劑增加ICH大鼠損傷腦區(qū)BDNF和TrkB mRNA表達 反轉(zhuǎn)錄PCR檢測結(jié)果顯示，與假手術(shù)組大鼠相比，造模后第7天，ICH大鼠損傷腦區(qū)BDNF和TrkB mRNA的表達明顯升高；而與模型組相比，不同劑量破血化瘀，填精補髓方劑均能明顯增加大鼠損傷腦區(qū)BDNF和TrkB mRNA表達，且受試藥中、高劑量組的效果更為顯著，但陽性藥物醒腦健神膠囊對大鼠損傷腦區(qū)BDNF和TrkB mRNA表達沒有明顯影響。

3 討 論

ICH后引起機體和腦組織局部產(chǎn)生一系列病理性反應，其中最重要的是局部腦血流量減少，腦內(nèi)血腫，血腫分解產(chǎn)物(凝血酶)和腦組織直接損傷釋放的各種血管活性物質(zhì)所致的腦水腫、顱內(nèi)壓增高及遲發(fā)性的神經(jīng)元損傷〔11〕，這些變化直接影響腦出血的預后。迄今為止尚缺乏確切有效的治療方法，如何降低患者的病死率及致殘率是目前急需解決的難題。

BDNF是一類多功能的多肽生長因子，廣泛存在于腦內(nèi)各組織，以大腦皮質(zhì)、海馬、紋狀體分布最為豐富。生理情況下，BDNF在中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常發(fā)育過程中，可調(diào)節(jié)神經(jīng)元的存活、分化和軸突導向；病理情況下，BDNF參與了腦損傷的保護過程〔12,13〕。在腦缺血損傷后，早期即有BDNF蛋白及mRNA的表達水平明顯升高，特別是在缺血相對耐受的齒狀回顆粒細胞中，出現(xiàn)BDNF蛋白及受體TrkB的持續(xù)表達，提示這些細胞可能通過產(chǎn)生BDNF，作為一種內(nèi)源性的神經(jīng)保護劑而抵抗缺血、缺氧，從而對局部缺血、缺氧的神經(jīng)元發(fā)揮潛在的保護作用。Cheng等〔14〕發(fā)現(xiàn)在缺血、缺氧性腦損傷后腦室內(nèi)給予BDNF有顯著的神經(jīng)保護作用，且早期應用效果更佳，并可上調(diào)TrkB受體，阻斷胞內(nèi)損傷因子對蛋白激酶C的失活，特異性防止神經(jīng)細胞缺血后的死亡〔15〕。實驗發(fā)現(xiàn)，在連續(xù)給受試藥第3天時，BDNF在血腫周圍表達明顯增加，于第7天達高峰，推測其一方面，可能為受試藥在腦內(nèi)促進在皮質(zhì)、海馬及血腫周圍的神經(jīng)元或膠質(zhì)細胞中合成，誘導BDNF蛋白表達及分泌增加，保護受損神經(jīng)元；另一方面，受試藥通過提高內(nèi)源性BDGF表達水平，與特異受體相結(jié)合，啟動細胞內(nèi)信號傳導途徑，產(chǎn)生相應的效應分子，調(diào)節(jié)神經(jīng)元和周圍結(jié)構(gòu)、促進神經(jīng)元存活、軸突再生而大鼠神經(jīng)系統(tǒng)病理體征具有明顯改善作用〔16〕。經(jīng)臨床研究證明了該受試藥可改善出血性腦卒中的中醫(yī)證候、減輕患者神經(jīng)功能缺損程度、 提高患者的生活能力和生活質(zhì)量，其有效率達到84.00%〔6〕。

另有研究表明，BDNF mRNA則主要表達于神經(jīng)元，部分表達于血腫周圍的活化小膠質(zhì)細胞〔17〕。傳統(tǒng)觀念認為，BDNF是一種靶源性的神經(jīng)生長因子，即BDNF在靶組織(如皮質(zhì)、海馬等)內(nèi)合成、分泌，作用于投射纖維終末的受體TrkB，形成配體-受體復合物，經(jīng)逆行轉(zhuǎn)運到神經(jīng)元的胞體而發(fā)揮神經(jīng)元存活。近來研究發(fā)現(xiàn)BDNF以類似出胞的形式分泌到細胞外基質(zhì)中而對臨近的神經(jīng)細胞發(fā)揮營養(yǎng)作用〔18〕。本實驗結(jié)果推測受試藥可能通過促進靶組織皮質(zhì)、海馬等處神經(jīng)元或膠質(zhì)細胞內(nèi)BNDF mRNA的表達。而BDNF mRNA表達的增高又可促進其基因表達產(chǎn)物-BDNF蛋白的合成與分泌,然后通過逆行運輸?shù)姆绞降竭_受損區(qū)域，從而發(fā)揮神經(jīng)營養(yǎng)作用，促進受損神經(jīng)元的存活。

TrkB是BONF的高親和力受體，主要分布于大鼠腦內(nèi)包括大腦皮質(zhì)、海馬齒狀回、黑質(zhì)-紋狀體、下丘腦、小腦、中腦頂蓋區(qū)和腦干等，其陽性顆粒不僅分布于神經(jīng)元胞體，而且延續(xù)到纖維，其中以海馬齒狀回和皮質(zhì)的含量最高，成為腦內(nèi)分布最為廣泛〔19〕。TrkB免疫組織化學染色結(jié)果表明，其作用機制可能BDNF與其特異性受體TrkB結(jié)合對突觸可塑性和神經(jīng)元具有保護作用。

VEGF是近年來發(fā)現(xiàn)的一種具有肝素結(jié)合活性的生長因子，為同性二聚體蛋白化合物，高度特異地作用于血管內(nèi)皮細胞，刺激血管內(nèi)皮細胞增殖，誘導體內(nèi)新生血管形成〔20〕。正常情況下表達水平很低，病理條件下，可在其血管內(nèi)皮中檢測到受體的高表達。眾多實驗已證實，腦缺血后VEGF的表達上調(diào)：主要是通過PKC途徑，通過促進內(nèi)皮細胞增生，在缺血區(qū)誘導大量新生血管形成，改善微循環(huán)，增加受累腦組織再灌注及供氧量，促進受損腦組織修復，加強神經(jīng)元的營養(yǎng)和神經(jīng)元功能的恢復〔21〕。有關(guān)VEGF在出血性腦血管病的病理機制中的作用，國內(nèi)外的研究多集中在VEGF對血腦屏障、腦水腫、腦損傷及腦保護等方面的影響。一部分學者認為VEGF可能參與ICH后血腦屏障的破壞，促進腦水腫的形成〔22〕并加劇缺血性神經(jīng)元的損傷〔23〕。另一部分學者則認為VEGF參與了ICH后血腦屏障的保護、減輕腦水腫及腦損傷，有神經(jīng)保護作用〔24〕。研究結(jié)果提示受試藥具有明顯的增加了損傷腦區(qū)VEGF陽性細胞數(shù)量。

綜上，破血化瘀、填精補髓法治療大鼠急性期ICH，可明顯改善神經(jīng)功能缺失癥狀，減輕腦血腫，促進腦水腫的吸收。其機制可能與促進BDNF表達，開通BDNF-TrkB通路，而達到神經(jīng)元細胞的保護及修復有關(guān)。

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