巨噬細胞移動抑制因子在動脈粥樣硬化中的作用及法舒地爾對其干預(yù)機制

王會春 張歡歡 盧 川 廉銀珠 趙慧穎

(吉林大學(xué)研究生院，吉林 長春 130021)

動脈粥樣硬化(AS)具有慢性炎癥的特點，脂質(zhì)過氧化可促進炎癥細胞的黏附和浸潤并能刺激炎性細胞表達增加而促進AS的發(fā)展。多種氧化型低密度脂蛋白(LDL)濃度升高和高密度脂蛋白(HDL)濃度降低是AS的主要危險因素,氧化應(yīng)激在AS及其他心腦血管病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，多個研究顯示Rho/Rho激酶途徑參與了氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)〔1，2〕。本實驗擬探討巨噬細胞移動抑制因子(MIF)及Rho激酶在AS形成過程中的作用及可能的機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物和分組 健康雄性Wistar大白鼠30只，體重220～250 g，購于吉林大學(xué)實驗動物中心。隨機分為三組：對照組(10只)，給予正?；A(chǔ)飼料、普通飲用水喂養(yǎng)9 w,開始實驗后7 d給予假球囊損傷手術(shù)；AS組(10只)，給予促進AS的飼料及普通飲用水喂養(yǎng)9 w；實驗開始時每只大鼠給予30萬U/kg維生素D3右下肢肌肉注射，促進AS飼料是在正常基礎(chǔ)飼料的基礎(chǔ)上加入2%總膽固醇(TC)、0.5%膽酸鈉、0.2%丙基硫氧嘧啶、維生素D3粉劑(1.25×106U/kg飼料)、3%豬油，開始實驗后 7 d行球囊損傷手術(shù)，每3周稱體重并給予上述劑量的維生素D3右下肢肌肉注射。法舒地爾組(10只)，給予促進AS的飼料及普通飲用水喂養(yǎng)9 w，實驗開始時每只大鼠給予30萬U/kg體重維生素D3右下肢肌肉注射，開始實驗后7 d行球囊損傷手術(shù)，球囊損傷后開始給予法舒地爾5 mg/kg，2次/d腹腔注射。每3周稱體重并給予上述劑量的維生素D3右下肢肌肉注射。

1.2標本采集 實驗開始9 w后，參照球囊損傷的常規(guī)方法進行動脈拉傷〔13,14〕，采集各組大鼠動脈血液及1 cm的動脈組織(主動脈弓部)，并立即用4%甲醛溶液固定，用于常規(guī)形態(tài)學(xué)和免疫組織化學(xué)檢查。將采集到的非抗凝血以3 000 r/min離心15 min，取1 ml分離出的血清，保存于-20℃的冰箱中，用于血脂檢測(取材前所有大鼠均禁食24 h)。TC、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、甘油三酯(TG)應(yīng)用全自動生化分析儀(XL20)檢測。病理形態(tài)學(xué)觀察包括HE染色、MIF的免疫組織化學(xué)檢測及Rho激酶的免疫組織化學(xué)檢測。

1.3主要試劑與儀器 微量移液器(芬蘭GILSON公司)，臺式低溫離心機(上海實驗儀器總廠)組織攤片機(德國LEICA公司 型號：HI 1220)，組織包埋機(德國LEICA公司 型號：EG 1150H)，鹽酸法舒地爾(川威：Rho激酶抑制劑；天津紅日藥業(yè)有限公司贈予)。MIF一抗，Rho激酶一抗(購自北京博奧森生物工程有限公司)，試劑盒SP-9710和二氨基聯(lián)苯胺(DAB)(購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)。

2 結(jié) 果

2.1實驗9 w后各組血脂變化情況比較 AS組TC、LDL-C、TG較對照組和法舒地爾組明顯升高，HDL-C明顯降低(P<0.05)。見表1。

表1 實驗9 w后各組血脂變化情況

2.2各組HE染色結(jié)果比較 圖1可見，對照組主動脈壁的內(nèi)膜、中膜、外膜層次清晰，內(nèi)皮細胞完整，中層的平滑肌細胞排列正常無增生，外層為疏松結(jié)締組織；AS組血管壁上存在典型的粥樣斑塊，內(nèi)膜增厚、纖維化，血管內(nèi)膜向管腔內(nèi)突出，斑塊內(nèi)可見泡沫細胞、脂質(zhì)沉積，內(nèi)膜可見少量炎性細胞和增生的平滑肌細胞，內(nèi)彈力板破壞，中膜平滑肌細胞明顯增生，并呈灶狀或片狀鈣化；法舒地爾組血管內(nèi)膜、中膜平滑肌細胞無明顯增生，可見少量散在的炎性細胞浸潤和泡沫細胞形成。

圖1 各組HE染色結(jié)果(×200)

2.3各組MIF和Rho激酶表達比較 AS組MIF和Rho激酶較對照組和法舒地爾組明顯升高，法舒地爾組MIF和Rho激酶表達較對照組明顯升高(P<0.05,P<0.01)。見表2。對照組可見MIF少量，表達少量Rho激酶陽性表達；AS組MIF表達明顯增多，大量Rho激酶陽性表達，法舒地爾組可見MIF呈點狀表達，Rho激酶在內(nèi)膜和斑塊中呈陽性表達，與AS組比較明顯減少。見圖2,圖3。

表2 各組MIF和Rho激酶表達比較

圖2 各組免疫組化染色MIF表達(×200)

圖3 各組免疫組化法Rho激酶表達(×400)

3 討 論

MIF是一種具有細胞因子、神經(jīng)內(nèi)分泌激素和酶等生物活性的細胞因子，其主要作用為抑制巨噬細胞的游走移動，促進巨噬細胞在炎癥局部浸潤、聚集、激活及分泌一些細胞因子，從而間接增強巨噬細胞的功能〔2〕。實驗證實〔3〕，在發(fā)生AS的血管處除巨噬細胞外，血管內(nèi)皮細胞及平滑肌細胞也可以分泌大量MIF，但這些細胞在正常情況下不會產(chǎn)生或僅產(chǎn)生少量MIF，而應(yīng)用MIF中和抗體及反義核酸技術(shù)阻斷MIF的表達則可以明顯延緩AS的發(fā)展，對已經(jīng)發(fā)生的粥樣斑塊阻斷MIF也可以使斑塊趨于穩(wěn)定〔3〕。這表明AS的發(fā)生可能與MIF之間存在密切的關(guān)系。在人巨噬細胞培養(yǎng)液中加入相同濃度的不同脂質(zhì),結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同脂質(zhì)對巨噬細胞表達MIF mRNA和蛋白水平的影響不同,LDL、氧化型LDL(ox-LDL)、和TG誘導(dǎo)巨噬細胞MIF mRNA和蛋白表達水平比對照組升高,而HDL和極低密度脂蛋白誘導(dǎo)巨噬細胞MIF mRNA和蛋白表達水平與對照組無明顯差別。提示,MIF可能參與了LDL、ox-LDL、TC和TG異常所致的AS進程，推測MIF可能是引發(fā)AS的重要因素〔4〕。

Rho GTP酶又稱小G蛋白，它通過激活其下游靶分子-Rho相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶(Rock)參與多種細胞信號的傳遞〔5〕。這些靶點蛋白被磷酸化后可激活信號傳導(dǎo)通路，導(dǎo)致細胞收縮、內(nèi)皮受損、血管平滑肌細胞增殖、炎性細胞浸潤等，最終促進AS形成。研究中發(fā)現(xiàn)，在人類和動物粥樣硬化的血管節(jié)段Rho激酶mRNA的表達增強，Rho激酶通過多種血管活性物質(zhì)相互作用，影響平滑肌的功能和結(jié)構(gòu)，直接參與心血管疾病的病理生理過程〔6〕。長期給予Rho激酶抑制劑可以降低AS斑塊大小及斑塊內(nèi)炎癥細胞的聚集〔7〕。Rho激酶降低內(nèi)皮細胞的屏障功能，在血管重塑的過程中亦起重要作用〔8〕。

本研究顯示MIF 與AS 呈正相關(guān)，Ross〔9〕在1993年提出了AS的炎癥學(xué)說，從炎癥角度解釋AS斑塊的形成過程，在各種損傷因素作用下正常內(nèi)皮細胞的生物學(xué)行為被破壞，內(nèi)皮細胞通透性增加、細胞表面黏附分子表達增加、內(nèi)皮抗凝/促凝血平衡失調(diào)，促使血液中的單核細胞遷移、浸潤到受損的血管內(nèi)皮下，吞噬ox-LDL后形成細胞源性泡沫細胞。損傷因素持續(xù)存在，炎癥反應(yīng)會進一步刺激平滑肌細胞遷移到內(nèi)膜下，轉(zhuǎn)變成分泌型的平滑肌細胞，分泌膠原和其他的活性分子，斑塊體積逐漸增大可向管腔內(nèi)突出，導(dǎo)致血管狹窄。載脂蛋白區(qū)Apo-E基因敲除小鼠在給予高膽固醇飲食喂養(yǎng)后可以形成類似于人類的AS斑塊；Fleckenstein等〔10〕結(jié)合人類AS斑塊的特點，提出了在高脂飲食的基礎(chǔ)上加鈣超載的方式建立大鼠AS的模型，在損傷大鼠動脈的基礎(chǔ)上，給予添加TC、膽酸鈉、維生素D3、丙基硫氧嘧啶后的飼料喂養(yǎng)，促進TC等的吸收造成高TC血癥，而且在高鈣鹽的作用下易形成鈣化，此AS模型與人類的AS的斑塊相似，所以本實驗采用大鼠制造AS模型。

本實驗表明在AS的形成過程中MIF發(fā)揮了一定的作用。另外，說明法舒地爾通過抑制Rho激酶的表達及活性進而抑制MIF的表達發(fā)揮其抗AS作用,本研究中發(fā)現(xiàn)Rho激酶抑制劑可以通過對MIF表達的干預(yù)進而發(fā)揮抗AS作用，探討MIF與Rho激酶在AS過程中可能存在相輔相成作用。

本實驗表明法舒地爾有降低血脂的作用，與文獻〔11〕報道一致，其抗AS作用可能與其降脂作用有關(guān)。他汀類藥物因其降脂、穩(wěn)定粥樣斑塊等在臨床上廣泛應(yīng)用于冠心病患者，多項研究結(jié)果表明Rho/Rho激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了他汀類藥物多效性的作用機制。他汀類藥物可通過抑制異戊烯化調(diào)節(jié)細胞內(nèi)小分子單體G蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而發(fā)揮調(diào)脂作用及其以外的多效性，而Rho激酶抑制劑法舒地爾可以直接抑制Rho激酶的表達及活性進而產(chǎn)生與他汀類藥物相同的降脂及抗AS的作用，但其具體機制尚不完全清楚，仍有待于前瞻性大量臨床研究。

4 參考文獻

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