D-半乳糖加亞硝酸鈉建立癡呆癥小鼠模型和中藥治療的效果

何 勝 玉 瑩 陳菊芳 張 元 潘福玉 李 海 梁雄壯 張樹球

(右江民族醫(yī)學(xué)院重金屬與氟砷毒物研究實(shí)驗(yàn)室，廣西 百色 533000)

流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果表明我國是世界上癡呆癥最多的國家之一〔1〕。由于它的病因、發(fā)病機(jī)制尚未清楚，因而尚無根治的藥物，已引起世界醫(yī)學(xué)界的關(guān)注及各國政府的重視。為研究疾病、發(fā)病機(jī)制和治療藥物，文獻(xiàn)中已建立有多種方法的動(dòng)物模型，各有優(yōu)點(diǎn)和不足〔2〕。本室陳莉等〔3〕也用何首烏制劑對(duì)D-半乳糖加亞硝酸鈉聯(lián)合造模小鼠進(jìn)行治療實(shí)驗(yàn),獲得了較好的結(jié)果,但沒有進(jìn)一步作大腦形態(tài)學(xué)變化的研究。本文仍用D-半乳糖加亞硝酸鈉聯(lián)合給小鼠皮下注射，建立動(dòng)物模型后并將中藥復(fù)方首烏口服液和海爾?？诜悍謩e用灌胃的方法給予治療，測定造模前后記憶能力變化,結(jié)束時(shí)測定血清和腦勻漿的生化指標(biāo)及腦組織形態(tài)學(xué)變化。

1 材料與方法

1.1試劑 D-半乳糖、亞硝酸鈉、氯化鈉，均為國產(chǎn)分析純。乙酰膽堿酯酶(AchE)測試盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)測試盒、總巰基(-SH)測試盒、甘油三酯(TG)測試盒、總膽固醇(TC)測試盒、鈣離子測試盒，購自南京建成生物工程研究所和四川省邁克科技有限責(zé)任公司。

1.2中藥 海爾?？诜?，由銀花、茯苓、甘草等中藥提取制成。復(fù)方首烏口服液，由何首烏(制)、龍眼肉提取制成。均由本院海爾福研究中心提供。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選用昆明種小白鼠48只，鼠齡2個(gè)月，健康，雌雄各半，分成四個(gè)組，每組12只。即正常組、模型組、治療1組、治療2組。分籠喂養(yǎng)，雌雄分開，每籠6只，小鼠編號(hào)，稱體重。由學(xué)院動(dòng)物室提供。

1.4AD模型的建立及治療 模型組、治療1組、治療2組均為造模組。D-半乳糖用生理鹽水溶解，配成9.8 mg/ml濃度，濾膜過濾除菌。放4℃冰箱保存待用。D-半乳糖按每天100 mg/kg體重劑量、亞硝酸鈉按45 mg/kg體重劑量〔3〕，兩溶液混合后作頸后皮下注射，每天1次，連續(xù)45天結(jié)束。造模到2 w后，治療組開始治療，治療1組用海爾?？诜?，取原液0.2 ml用蒸餾水稀釋至0.4 ml灌胃，每天1次；治療2組用復(fù)方首烏口服液，取原液0.2 ml用蒸餾水稀釋至0.4 ml灌胃，每日1次。模型組和正常組用等體積的蒸餾水代替，方法相同，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

1.5測定方法 AchE根據(jù)本酶催化乙酰膽堿生成膽堿和乙酸，膽堿可與巰基顯色劑反應(yīng)生成對(duì)稱三硝基苯(TNB)黃色化合物，顏色深淺進(jìn)行比色定量，水解產(chǎn)物膽堿的數(shù)量反映一線膽堿酯酶的活力。具體操作參考試劑盒說明書。GSH-PX活力測定根據(jù)GSH-PX催化過氧化氫(H2O2)與還原型谷胱甘肽(GSH)反應(yīng)，用GSH被消耗的量來計(jì)算GSH-PX活力，具體操作參考試劑盒說明書。-SH測定用巰基顯色劑顯色反應(yīng)(黃色)，412 nm波長比色測定。鈣離子測定利用鈣離子與甲基百里香酚藍(lán)(MTB)結(jié)合，生成藍(lán)色絡(luò)合物，比色測定。TG用GPO-PAP法、TC用COD-CE-PAP法測定，具體操作參考試劑和說明書。水迷宮游水時(shí)間測定，利用y型水迷宮，開始預(yù)先訓(xùn)練5天，每天游水訓(xùn)練3次，使其熟悉上岸地點(diǎn)(逃命)，計(jì)算下水到達(dá)上岸地點(diǎn)時(shí)間(s)和錯(cuò)誤率。統(tǒng)計(jì)時(shí)把超過10 s以上按10 s計(jì)，參考文獻(xiàn)〔4〕。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行方差分析，Q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組-SH,AchE,GSH-PX測定結(jié)果 治療1組腦-SH活性最高，其余3組差異不明顯； AchE活性最低是模型組，最高正常組； GSH-PX活性最高是正常組，最低是模型組。見表1。

2.2血清TC,TG,腦鈣含量 模型組TG明顯高于治療1組(P<0.05)；TC治療2組明顯高于其他組。腦鈣含量治療組明顯升高。見表2。

表1 各組-SH,AchE，GSH-PX水平比較

表2 血清TC,TG,腦鈣含量比較

2.3小鼠造模前后水迷宮游水時(shí)間 造模前后水迷宮游水時(shí)間各組間無顯著差異(P>0.05),但造模后時(shí)間均縮短了；錯(cuò)誤率除模型組沒有降低外,其他均顯著降低。見表3。

表3 造模前后水迷宮游水時(shí)間比較

2.4大腦皮質(zhì)病理切片檢查結(jié)果 圖1可見，對(duì)照組的大腦皮質(zhì)的分子層、外顆粒層、外錐體層和內(nèi)顆粒光鏡層分界清楚，顆粒細(xì)胞數(shù)量和體積正常，胞質(zhì)的尼氏體豐富。模型組大腦皮質(zhì)分層不清楚顆粒細(xì)胞數(shù)量明顯減少，胞質(zhì)的尼氏體也減少，有較多的神經(jīng)元萎縮、變性和凋亡。治療組的病理改變得到很好改善，顆粒細(xì)胞數(shù)量增多，神經(jīng)元胞質(zhì)尼氏體也增多，其中治療2組病理改變得到改善最為明顯。

圖1 各組大鼠大腦皮質(zhì)病理學(xué)觀察(HE，×200)

3 討 論

在AD的病因?qū)W中和發(fā)病機(jī)制中，膽堿能損傷學(xué)說是目前較為公認(rèn)的，老年癡呆癥大腦的膽堿能學(xué)說發(fā)生嚴(yán)重的潰變，引起老年性學(xué)習(xí)記憶減退和認(rèn)知障礙，產(chǎn)生癡呆癥狀。正常基底前腦的膽堿能神經(jīng)元(主要位于基底核、斜角帶核和內(nèi)側(cè)隔核)合成大量乙酰膽堿能投射纖維輸送到海馬和大腦皮質(zhì)。乙酰膽堿被認(rèn)為與學(xué)習(xí)和記憶有關(guān)。在發(fā)生AD時(shí)，基底前腦的膽堿能神經(jīng)元丟失，造成乙酰膽堿的合成、儲(chǔ)存、釋放減少，從而導(dǎo)致以記憶和識(shí)別功能障礙為主的多種臨床表現(xiàn)，同時(shí)測定AchE活性降低〔1〕，額葉、頂葉皮質(zhì)中膽堿含量也會(huì)明顯降低。

自由基損傷學(xué)說也是AD的病因?qū)W和發(fā)病機(jī)制的重要學(xué)說。自由基是外層軌道具有不配對(duì)電子的原子、分子式基團(tuán)，具有化學(xué)活性強(qiáng)、連鎖反應(yīng)的特點(diǎn)。正常情況下，人體氧代謝過程中產(chǎn)生低濃度生理范圍的自由基，但若產(chǎn)生過多或清除能力減弱，就會(huì)對(duì)機(jī)體造成傷害。自由基損傷生物膜會(huì)造成細(xì)胞內(nèi)環(huán)境紊亂，導(dǎo)致細(xì)胞老化、死亡。自由基損傷脂類產(chǎn)生過氧化，過氧化脂質(zhì)分解時(shí)可產(chǎn)生丙二醛等醛類，與磷酸、蛋白結(jié)合形成脂褐素，沉積于腦導(dǎo)致智力障礙。

本實(shí)驗(yàn)AD模型組小鼠大腦AchE活性明顯降低。正常組、治療1組、治療2組AchE酶活性明顯高于模型組，其中復(fù)方首烏治療2組更接近正常組，效果更明顯。研究表明〔5〕，大腦學(xué)習(xí)記憶能力與膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)有密切關(guān)系，乙酰膽堿是此系統(tǒng)重要的神經(jīng)遞質(zhì)，它由乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶(CAT)催化合成，釋放后作用于M-受體，發(fā)揮生理功能后，又被AchE催化分解成膽堿和乙酸，保持一種動(dòng)態(tài)平衡，是認(rèn)知功能得以正常發(fā)揮。AD患者腦組織中，由于神經(jīng)細(xì)胞功能減退、酶活力及記憶力、認(rèn)知能力減退，其機(jī)制仍不十分清楚。目前在病理形態(tài)方面發(fā)現(xiàn)患者大腦中存在的老年斑和神經(jīng)纖維纏結(jié)，是研究的熱點(diǎn)。老年斑中存在大量不溶性的β淀粉折疊蛋白，是由于可溶性的α螺旋空間構(gòu)象轉(zhuǎn)變成不溶性β-折疊構(gòu)象，這是一種機(jī)制不十分明了的空間構(gòu)象的轉(zhuǎn)變的形式。另一方面是神經(jīng)纖維變性、纏結(jié)，機(jī)理也不明了。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組在D-半乳糖和亞硝酸鈉聯(lián)合作用下，AchE活力明顯降低，病理形態(tài)學(xué)也發(fā)生一定的改變,與文獻(xiàn)報(bào)道一致〔6〕。而用復(fù)方首烏治療2組，TchE活力恢復(fù)較好，接近正常組，已有研究表明，何首烏含二苯乙烯，是其有效成分之一，對(duì)AD有較好的治療作用〔7〕。治療1組用海爾福口服液，其功能是排毒作用，并有較好的自由基清除能力，因而也有一定的恢復(fù)酶活力。

腦組織GSH-PX活力，模型組明顯低于正常組和復(fù)方首烏口服液治療2組。GSH-PX是催化過氧化氫(H2O2)與還原型谷胱甘肽(GSH)反應(yīng)生成水(H2O)H和氧化型谷胱甘肽(G-S-S-G)的酶類，從而清除代謝過程中產(chǎn)的H2O2，是機(jī)體清除活性氧(包括 ·OH和H2O2等)的主要抗氧化酶類，對(duì)機(jī)體具有保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)表明其抗氧化功能提高，對(duì)大腦功能也有保護(hù)作用，治1組用海爾?？诜褐委熀螅珿SH-PX活力也有一定的提高，同時(shí)本組-SH含量也明顯高于其他各組，-SH是機(jī)體抗氧化功能的重要成分，對(duì)機(jī)體也有保護(hù)作用?？偟恼f明治療組均有較強(qiáng)的抗氧化功能，對(duì)大腦保護(hù)較好。

在AD的神經(jīng)細(xì)胞中，磷酸戊糖途徑被激活，大量產(chǎn)生NADPH，促進(jìn)GSH和自由硫基產(chǎn)生，這些分子都是細(xì)胞對(duì)抗氧化的關(guān)鍵。另外，一些抗氧化蛋白，如SOD、過氧化氫酶、GSH-PX等在病人海馬中有所升高，以利于自由基的清除。

鈣代謝自體平衡失調(diào)與腦老化或老年癡呆的關(guān)系，近年來已引起廣泛的關(guān)注〔1〕。許多研究表明，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度過高會(huì)使鈣依賴性生理生化反應(yīng)超常運(yùn)轉(zhuǎn)、耗竭ATP、產(chǎn)生自由基，甚至引起細(xì)胞死亡。對(duì)AD的研究發(fā)現(xiàn)，在會(huì)有神經(jīng)元纖維纏結(jié)(NFT)的細(xì)胞可見到Ca+的堆積。其堆積可能有幾個(gè)途徑，一是外源性Ca2+的內(nèi)流增加，在神經(jīng)遞質(zhì)合成、釋放異常情況下，引起鈣通道開放，胞外的Ca2+大量進(jìn)入細(xì)胞；另一原因可能是內(nèi)源性Ca2+釋放增加，細(xì)胞器內(nèi)儲(chǔ)存有大量的鈣，稱鈣庫，大量釋放到胞質(zhì)。

4 參考文獻(xiàn)

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