雌二醇對岡田酸誘導的SH-SY5Y細胞tau蛋白磷酸化的影響

李凱軍 胡江平

(牡丹江醫(yī)學院，黑龍江 牡丹江 157011)

過度磷酸化的tau蛋白與阿爾茨海默病(AD)的形成和發(fā)展有著密切的聯(lián)系〔1〕。岡田酸(OA)是一種蛋白磷酸酯酶抑制劑，能抑制磷酸酯酶的活性，使蛋白高度磷酸化，并可以引起氧化損傷，在離體培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元中能夠誘導tau蛋白過度磷酸化；同時，OA在體內(nèi)能促進Aβ沉積，造成神經(jīng)元退化，突觸缺失及記憶障礙，產(chǎn)生類AD樣病理特征。雌激素(E2)在AD的發(fā)生、發(fā)展及預后中起到十分重要的作用。E2可通過多種方式發(fā)揮其對AD的保護作用，如促進神經(jīng)突觸生長和重塑、參與中樞神經(jīng)遞質的調節(jié)、減少β淀粉樣蛋白(Aβ)的沉積、抗氧化和抗自由基作用、維持胞內(nèi)鈣的平衡、調節(jié)載脂蛋白E(ApoE)的表達等，但對細胞tau蛋白磷酸化的影響尚未見報道。絕經(jīng)后婦女AD的發(fā)病率較同年齡組的男性高2～3倍，由于女性絕經(jīng)后雌激素水平急劇降低，而同齡男性產(chǎn)生的睪丸酮在腦內(nèi)經(jīng)P-450芳香化酶作用可轉變成雌激素〔2〕。流行病學研究亦證實AD的發(fā)病與絕經(jīng)后婦女喪失雌激素的保護作用有關〔3〕。本研究觀察E2對OA誘導的SH-SY5Y細胞tau蛋白磷酸化的影響。

1 材料與方法

1.1材料 人神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y細胞購自中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所，小鼠抗p-tau (Thr231) 購自美國Invitrogen公司，小鼠抗GAPDH抗體購自Kangchen公司，PVDF膜購自美國Millpore公司，蛋白Marker購自NEB公司，ECL試劑盒購自美國Pierce公司，OA購自美國Santa cruz公司，四甲基偶氮唑鹽(MTT)購自美國Sigma公司，胎牛血清購自美國Invitrogen公司，DMEM培養(yǎng)基購自美國Invitrogen公司，多聚賴氨酸購自武漢博士德生物公司，DMSO購自美國Sigma公司，胰蛋白酶購自美國Invitrogen公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2實驗分組 常規(guī)細胞培養(yǎng)后，分為六組，V為空白對照組，C為OA處理組，T1、T2、T3、T4分別為10 nmol/L、100 nmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L OA+E2處理組。SH-SY5Y細胞經(jīng)40 mmol/L OA處理12 h后，加入不同濃度的E2(T1，T2，T3，T4分別為10 nmol/L,100 nmol/L,1 μmol/L,10 μmol/L)作用6 h，提取細胞蛋白，檢測總tau和p-tau在Thr231位點的表達水平。

1.3細胞培養(yǎng) 10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，CO2培養(yǎng)箱中37℃，5% CO2，100%濕度靜置培養(yǎng)。

1.4MTT測定 細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液配成單細胞懸液，每孔100 μl接種于96孔培養(yǎng)板，移入培養(yǎng)箱，待細胞完全貼壁后，每孔加入含有OA的培養(yǎng)液，濃度分別為10，20，40，80，160 nmol/L，對照組加等體積的培養(yǎng)液。每種濃度6個復孔，培養(yǎng)12 h后，每孔加入MTT(5 mg/ml) 20 μl，繼續(xù)孵育3 h，棄上清，每孔加DMSO 150 μl，在水平搖床上震蕩10 min，使結晶物充分溶解，酶標儀測定光密度值(490 nm)。

1.5Western印跡檢測 收集細胞后提取蛋白、測定濃度，經(jīng)灌膠、加樣、電泳、轉膜、封閉、一抗及二抗孵育后，應用HRP-ECL發(fā)光法檢測蛋白，用BIO-RAD凝膠電泳圖像分析儀進行圖像采集，Quantity One軟件進行圖像分析。

2 結 果

2.1OA對SH-SY5Y細胞活力的影響 SH-SY5Y細胞經(jīng)不同濃度OA處理12 h后，測定OD值，以正常對照組細胞活力為100%，其余各組OD值與之相比得到各自的細胞活力。我們選擇細胞活力在80%以上的藥物濃度處理細胞。10、20、40、80、160 nmol/L OA組細胞活力為(92.57%±13.95%)(87.48%±14.58%)(80.48%±11.93%)(60.58%±5.69%)(45.42%±4.36%)。當OA濃度大于40 nmol/L時，細胞活力受到明顯的抑制，且隨著OA濃度的增加而增強，而低于此濃度的OA對細胞活力沒有明顯的影響。

2.2E2對OA處理的SH-SY5Y細胞tau蛋白磷酸化的影響 Western印跡結果顯示，C與V組相比，tau蛋白磷酸化的水平明顯增加(185.41%±8.06% vs 100%±5.92%,P<0.05)，而T1、T2、T3、T4組tau蛋白磷酸化水平都明顯降低〔(141.91±3.73)%、(116.63±6.55)%、(110.04±6.32)%、(94.58±6.21)%〕。T4組的tau蛋白磷酸化水平與C組相比降低了90.8%(P<0.05)，與V組水平無明顯差異，光密度值以GAPDH作為內(nèi)參校正。見圖1。

圖1 E2對OA處理的SH-SY5Y細胞tau蛋白磷酸化的影響

3 討 論

Tau蛋白的正常功能是促進微管蛋白組成微管，并維持微管的穩(wěn)定性。微管參與維持細胞形態(tài)、信息傳遞、細胞分裂等重要生物學過程，AD的重要病理變化之一是神經(jīng)細胞內(nèi)的神經(jīng)原纖維纏結，其主要成分就是過度磷酸化的tau蛋白〔4〕，在AD腦組織中，異常過度磷酸化的tau蛋白含量顯著增高，并聚集成雙螺旋細絲(PHFs)，tau磷酸化程度的增加使tau結合微管的能力下降，從而喪失了促進微管組裝的生物活性，導致細胞骨架的結構異常和神經(jīng)細胞死亡。AD患者腦的tau蛋白異常過度磷酸化，每分子tau蛋白可含5～9個磷酸基，目前發(fā)現(xiàn)，AD患者有21個異常磷酸位點,多個磷酸位點的磷酸化更易導致tau蛋白的微管結合功能喪失,其中研究較多的有181、199、231、396及404等多個磷酸化位點,已在AD患者的腦脊液中檢測到高濃度上述位點的p-tau蛋白,并具有較高的特異性和敏感性,因此，本實驗選取Thr231位點進行檢測。

OA是一種海洋生物提取物，對蛋白磷酸酶PP2A和PP1具有抑制作用，從而阻止tau蛋白的去磷酸化〔5〕，OA能使神經(jīng)元微管相關蛋白tau異常過度磷酸化，產(chǎn)生神經(jīng)毒性，包括產(chǎn)生AD樣的病理過程。因此我們選用它來制造AD時tau蛋白過度磷酸化的細胞模型。MTT表明OA濃度大于40 nmol/L時，細胞活力受到明顯的抑制，因此選擇40 mmol/L OA處理12 h作為制備AD時tau蛋白過度磷酸化的細胞模型時OA最佳作用濃度和作用時間。

雌激素是類固醇類激素，它主要是由性腺產(chǎn)生，包括體內(nèi)有雌二醇(E2)、雌三醇(E3)和雌酮(E1)3種類型。其中E2的生物活性最強，AD患者腦中的類固醇激素水平，與比正常人相比普遍降低，并發(fā)現(xiàn)神經(jīng)類固醇激素的含量與AD的兩大生物化學特征顯著相關〔6〕，即與過度磷酸化tau蛋白(形成PHF-tau)和β淀粉樣肽相關。雌激素的長期缺乏將影響神經(jīng)功能，與AD的發(fā)生、發(fā)展密切相關，Twist等〔7〕用放免法對照測定AD病人和正常老年人腦中E2的含量，發(fā)現(xiàn)正常男性腦中的E2的量比正常女性高3.5倍，而AD患者中男女E2的比例沒有明顯的不同。對大量人群的回顧性及前瞻性研究和體外實驗表明，雌激素替代療法(ERT)不僅對AD的治療有效，而且能預防AD的發(fā)病和推遲發(fā)病年齡〔8〕。

本實驗表明E2對tau蛋白磷酸化有明顯的抑制作用，說明E2對AD的治療具有積極的作用，其機制很可能是通過減少tau蛋白磷酸化水平而發(fā)揮作用的。

4 參考文獻

1Hu JP，Xie JW，Wang CY,etal.Valproate reduces tau phosphorylation via cyclin-dependent kinase 5 and glycogen synthase kinase 3 signaling pathways〔J〕.Brain Res Bull，2010；85(3-4)：194-200.

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4Grundke-Iqbal I，Iqbal K，Tung YC,etal.Abnormal phosphorylation of the microtubule-associated protein tau (tau) in Alzheimer cytoskeletal pathology〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A，1986；83(13)：4913-17.

5Planel E，Yasutake K，F(xiàn)ujita SC,etal.Inhibition of protein phosphatase 2A overrides tau protein kinase I/glycogen synthase kinase 3 beta and cyclin-dependent kinase 5 inhibition and results in tau hyperphosphorylation in the hippocampus of starved mouse〔J〕.J Biol Chem，2001；276(36)：34298-306.

6Rosario ER,Carroll J，Pike CJ.Testosterone regulation of Alzheimer-like neuropathology in male 3xTg-AD mice involves both estrogen and androgen pathways〔J〕.Brain Res，2010；1359：281-90.

7Twist SJ,Taylor GA，Weddell A,etal.Brain oestradiol and testosterone levels in Alzheimer′s disease〔J〕.Neurosci Lett，2000；286(1)：1-4.

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