右歸丸對(duì)EAE小鼠Th17細(xì)胞分化的影響

鄭子安 鐘相根 賈 旭 王 坦

(北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京 100029)

多發(fā)性硬化癥(MS)是一種緩慢進(jìn)展的中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性炎性脫髓鞘疾病〔1〕，其發(fā)病機(jī)制尚未闡明。新近研究表明，Th17細(xì)胞是炎癥反應(yīng)和自身免疫性疾病中一類重要的效應(yīng)細(xì)胞〔2〕。目前，西醫(yī)尚無(wú)特效療法，臨床上治療MS的藥物包括糖皮質(zhì)激素、β-干擾素、環(huán)孢霉素A等。這些藥物雖可明顯改善MS患者急性期的臨床癥狀，但尚無(wú)循證醫(yī)學(xué)的證據(jù)表明其可有效控制疾病復(fù)發(fā)及減緩疾病進(jìn)展，而且由于毒副作用限制了它們的臨床應(yīng)用，不宜作為長(zhǎng)期維持治療用藥。近年來(lái)，我國(guó)學(xué)者研究表明，右歸丸可有效治療大鼠EAE〔3，4〕，本研究觀察右歸丸對(duì)EAE小鼠血清IL-4、IL-6、TGF-β、IL-17含量的影響，探討右歸丸能否通過(guò)抑制Th17細(xì)胞分化，進(jìn)而治療EAE。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)C57BL/6小鼠，雌性，40只，6～8周齡，體質(zhì)重18～20 g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司〔許可證號(hào)：SCXK(京)2007-0001〕，飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2試劑及儀器 MOG35-55，純度>97.25%，肽序列為MEVGW YRSPF SRVVH LYRNGK(生工生物工程(上海)有限公司)。完全弗氏佐劑(Complete Freud's Adjuvant，CFA)購(gòu)于sigma。百日咳毒素(Pertussis toxin)來(lái)源于Bordetella pertusssis。人結(jié)核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis，H37Ra) (Difco company，USA)。ELISA試劑盒購(gòu)自欣盛博生物科技有限公司。

1.3實(shí)驗(yàn)分組及處理 將EAE模型小鼠隨機(jī)分為模型組、激素組、右歸丸組，另設(shè)正常對(duì)照組，共4組，每組10只。免疫后，按組別分別做如下處理：模型組每天給予生理鹽水灌胃；激素組每天給予生理鹽水灌胃，發(fā)病后改為醋酸潑尼松混懸液(7 mg/kg，用生理鹽水配制成要求的濃度)；右歸丸組每天給予右歸丸(4.2 g/kg，用生理鹽水配制成要求的濃度)混懸液灌胃。正常對(duì)照組：相同條件和環(huán)境中飼養(yǎng)，不作任何處理。

每組實(shí)驗(yàn)小鼠在造模后于免疫后第30天取材。分離血清，4℃保存待測(cè)。HE染色觀察取材用10%水合氯醛經(jīng)腹腔注射麻醉小鼠，剪開胸部，將灌注針由左心室穿入主動(dòng)脈，依次注入0.9%生理鹽水、4%多聚甲醛；經(jīng)心灌注30 min后，完整取出腦組織固定于0.1 kg/L甲醛磷酸緩沖液中24 h，石蠟包埋以備切片；取出石蠟塊連續(xù)切片，5 μm切片行HE染色。

1.4小鼠EAE模型建立 按照課題組建立的方法構(gòu)建EAE小鼠模型〔5〕。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：將MOG35-55(4 mg/ml，用滅菌后PBS配制相應(yīng)濃度)與等體積的CFA(含4 mg/ml的H37Ra)用已經(jīng)滅菌玻璃注射器充分乳化。用乙醚麻醉C57BL/6小鼠，分3點(diǎn)給小鼠背部皮下注射(100 μl/只)乳化液。背部?jī)杉缯小⒑蟊巢恐芯€兩側(cè)各33.3 μl。最終每只小鼠皮下注射的MOG35-55和H37Ra均為200 μg。在免疫當(dāng)天給每只小鼠腹腔注射400 ng PTX。在免疫72h后給每只小鼠再次腹腔注射400 ng PTX。

1.5小鼠神經(jīng)功能評(píng)分 從初次免疫第0天起至第30天實(shí)驗(yàn)終止前，采用盲法，每天2人至少一次在同一時(shí)間按Benson評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)EAE嚴(yán)重性進(jìn)行臨床評(píng)估。0分，沒(méi)有明顯疾病癥狀；1分，尾巴張力消失或者后肢無(wú)力；2分，尾巴張力消失和后肢無(wú)力；3分，后肢部分癱瘓；4分，后肢完全癱瘓；5分，瀕死狀態(tài)或者死亡。

1.6ELISA法檢測(cè)IL-4、TGF-β、IL-6、IL-17含量 按試劑盒操作說(shuō)明，檢測(cè)血清中IL-4、TGF-β、IL-6、IL-17含量。

2 結(jié) 果

2.1血清IL-4、TGF-β、IL-6、IL-17含量變化 如表1所示，模型組IL-6、IL-17含量比正常組升高，IL-4、TGF-β含量比正常組降低(P<0.05，P<0.01)。與模型組比較，右歸丸及潑尼松組IL-6、IL-17含量降低，IL-4、TGF-β含量升高(P<0.05，P<0.01)。

2.2EAE小鼠發(fā)病率、神經(jīng)功能評(píng)分及體重變化 免疫誘導(dǎo)后15 d開始，小鼠逐漸發(fā)病，表現(xiàn)為活動(dòng)減少、體重減輕、尾部及四肢無(wú)力，符合EAE小鼠模型表現(xiàn)。右歸丸及潑尼松干預(yù)后發(fā)病率降低、神經(jīng)功能評(píng)分及體重減輕均明顯改善。各組小鼠發(fā)病率、神經(jīng)功能評(píng)分、體重變化分別見圖1、圖2、圖3。

表1 各組小鼠調(diào)控Th17細(xì)胞分化的細(xì)胞因子比較

圖1 各組小鼠發(fā)病率比較

圖2 各組小鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較

圖3 各組小鼠體重變化比較

2.3EAE小鼠腦組織病理學(xué)改變 HE染色觀察，正常對(duì)照組未見明顯的炎癥改變。EAE模型組小鼠大腦實(shí)質(zhì)內(nèi)可見大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，部分微血管周圍被炎癥細(xì)胞圍繞，形成典型的“血管袖套樣”改變。右歸丸及潑尼松組腦組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯改善。

3 討 論

EAE與人類MS的病理變化極其相似，是研究MS 的經(jīng)典動(dòng)物模型。長(zhǎng)期以來(lái)，EAE/MS被認(rèn)為是以IL-12誘導(dǎo)的Th1細(xì)胞反應(yīng)為主的自身免疫性疾病。然而，一系列的矛盾困擾著人們。如IL-12是Th1分化的關(guān)鍵因子，IL-12基因敲除小鼠仍能產(chǎn)生EAE〔6〕。IFN-γ是Thl的重要致病因子，然而IFN-γ基因敲除小鼠仍能誘導(dǎo)產(chǎn)生EAE，而且恢復(fù)緩慢。Th17細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)和IL-23功能的研究，解釋了以上的困惑。

Th17細(xì)胞是新近發(fā)現(xiàn)的一類CD4+細(xì)胞亞群，因其獨(dú)特的表型特征和分泌IL-17而得名，是和Th1細(xì)胞亞群、Th2細(xì)胞亞群相對(duì)應(yīng)的一組細(xì)胞亞群〔7，8〕。Th17細(xì)胞亞群具有高度的致病性，Th17細(xì)胞和IL-17在EAE的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵性作用〔9〕。Th17細(xì)胞通過(guò)分泌一系列的促炎因子如IL-17、IL-17F、TNF-α、IL-6而發(fā)揮作用。IL-17作為IL-17家族的代表性因子，可以發(fā)現(xiàn)在EAE中表達(dá)升高；IL-17基因敲除小鼠對(duì)EAE不敏感；抗IL-17抗體可以使EAE癥狀明顯減輕〔10〕。TGF-β與IL-6的協(xié)同作用是誘導(dǎo)Th17細(xì)胞分化的關(guān)鍵因子，TGF-β與IL-6能促進(jìn)幼稚性Nalve CD4+細(xì)胞向Thl7細(xì)胞分化〔11〕。其中IL-6 起著關(guān)鍵性的作用，IL-6基因敲除小鼠EAE表現(xiàn)明顯減輕；在小鼠EAE模型中使用IL-6抗體后，IL-17的分泌明顯減少，且小鼠癥狀明顯減輕〔12〕。TGF-β的免疫調(diào)節(jié)功能呈現(xiàn)劑量依賴性，低濃度時(shí)表現(xiàn)為協(xié)同IL-6誘導(dǎo)Th17細(xì)胞的分化，而在高濃度時(shí)則誘導(dǎo)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的分化，其中前者可以誘導(dǎo)EAE的發(fā)生而后者介導(dǎo)免疫抑制〔13〕。而Th2型細(xì)胞因子IL-4對(duì)Th17細(xì)胞分化起抑制作用〔14〕。

既往研究表明，右歸丸可有效治療大鼠EAE。本實(shí)驗(yàn)研究顯示，右歸丸可改善EAE小鼠神經(jīng)功能評(píng)分，降低EAE小鼠血清IL-6、IL-17含量，升高IL-4、TGF-β含量，提示右歸丸可通過(guò)抑制Th17細(xì)胞分化而起到抗感染治療作用，進(jìn)而改善EAE神經(jīng)功能評(píng)分。

綜上，右歸丸能夠通過(guò)影響Th17細(xì)胞分化，起到抗感染治療作用，為右歸丸在多發(fā)性硬化中的應(yīng)用提供新理論依據(jù)。

4 參考文獻(xiàn)

1Holm?y T.Immunopathogenesis of multiple sclerosis：concepts and controversies〔J〕.Acta Neurol Scand Suppl，2007；187:39-45.

2Zhou W，Dowell DR，Huckabee MM,etal.Prostaglandin I2 signaling drives Th17 differentiation and exacerbates experimental autoimmune encephalomyelitis〔J〕.PLoS One，2012;7(5):e33518.

3葉 明，樊永平，王 蕾.左歸丸與右歸丸對(duì)EAE大鼠淋巴細(xì)胞亞群和NK細(xì)胞的影響〔J〕.中華中醫(yī)藥雜志，2009；24(3)：310-3.

4樊永平，宋麗君，葉 明.左歸丸和右歸丸對(duì)自身免疫性腦脊髓炎大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴細(xì)胞亞群免疫組化表達(dá)的影響〔J〕.中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2010；17(6)：44-7.

5Zhu YN，Zhong XG，F(xiàn)eng JQ,etal.Periploside E inhibits experimental allergic encephalomyelitis by suppressing interleukin 12-dependent CCR5 expression and interferon-gamma-dependent CXCR3 expression in T lymophocyte〔J〕.J Pharmacol Exp Ther,2006；318(3):1153-62.

6Zhang GX，Bruno GN，Shuo YU,etal.Induction of experimental autoimmune encephalomyelitis in IL-12 receptor-β2-deficient mice：IL-12 responsiveness is not required in the pathogenesis of inflammatory demyelination in the central nervous system〔J〕.J Immunol，2003；170：2153-60.

7Harrington LE，Hatton RD，Mangan PR,etal.Interleukin 17-producing CD4+effector T cells develop via a lineage distinct from the T helper type 1 and 2 lineages〔J〕.Nat Immunol，2005;6(11):1123-32.

8Park H，Li Z，Yang XO,etal.A distinct lineage of CD4 T cells regulates tissue inflammation by producing interleukin 17〔J〕.Nat Immunol，2005;6(11):1133-41.

9Komiyama Y，Nakae S，Matsuki T,etal.IL-17 plays an important role in the development of experimental autoimmune encephalomyelitis〔J〕.J Immunol，2006;177(1):566-73.

10Weaver CT.Th17：the ascent of a new effector T-cell subset〔J〕.Eur J Immunol，2009;39(3):634-6.

11Mangan PR，Harrington LE，O'Quinn DB，etal.Transforming growth factor-beta induces development of the T(H)17 lineage〔J〕.Nature,2006;441(7090):231-4.

12Okuda Y，Sakoda S，Bernard CC,etal.IL-6-deficient mice are resisitant to the induction of experimental autoimmune encephalomyelitis provoked by myelin oligodendrocyte glycoprotein〔J〕.Int Immunol,1998；10:703-8.

13Zhou L,Lopes J，Chong M，etal.TGF-B- induced Foxp3 inhibits Th17 cell differentiation by antagonizing RORCt function 〔J〕.Nature，2008；453(7192)：236-40.

14Wahl SM，Wen J，Moutsopoulos N.TGF-beta：a mobile purveyor of immune privilege〔J〕.Immunol Rev，2006;213:213-27.