殼寡糖對S180荷瘤鼠P53、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

官 杰 興桂華 莊旭東 王 琪

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院免疫教研室,黑龍江 齊齊哈爾 161006)

幾丁質(zhì)又名殼多糖、甲殼質(zhì)，廣泛存在于昆蟲、甲殼類動物外骨骼和真菌細(xì)胞壁及一些綠藻中，是由N-乙酰氨基葡萄糖聚合而成的多糖。幾丁質(zhì)經(jīng)脫乙酰化處理后得到殼聚糖。海洋殼聚糖是一種由β-1,4-糖苷鍵連接而成的多糖，進(jìn)一步解聚可以生成水溶性殼寡糖，后者具有多種生物活性。近十幾年來，殼聚糖的研究已在國內(nèi)外廣泛展開，它們具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤及降血脂等功能，但由于其不溶于水，在開發(fā)應(yīng)用上受到很大限制。殼寡糖不但水溶性好，易被人體吸收，還展現(xiàn)出獨特優(yōu)越的多種生理功能，主要表現(xiàn)在：能夠調(diào)節(jié)動物腸道內(nèi)微生物代謝活動，選擇的活化有益菌，促進(jìn)雙歧桿菌生長〔1〕；促進(jìn)抗體生成、抑制腫瘤生長〔2,3〕；降低血壓、血糖、吸附膽固醇；活化植物細(xì)胞、促進(jìn)植物細(xì)胞快速增長〔4〕等。其抗腫瘤作用主要是通過直接抑制細(xì)胞增生、誘導(dǎo)細(xì)胞壞死和凋亡、影響腫瘤血管生成和遷移、增強(qiáng)機(jī)體免疫力實現(xiàn)的。本文以S180荷瘤鼠作為研究對象，通過體內(nèi)實驗，觀察殼寡糖對腫瘤細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用，探討殼寡糖抗腫瘤作用機(jī)制,為殼寡糖臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要試劑、動物及儀器 殼寡糖由哈爾濱工業(yè)大學(xué)提供；環(huán)磷酰胺由上海華聯(lián)制藥有限公司生產(chǎn)；P53單抗、Bcl-2單抗免疫組化染色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；S180瘤株，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)免疫教研室提供，昆明小鼠，雌雄各半，質(zhì)量18～22 g，由齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供。

1.2方法

1.2.1實驗方法 取腹腔接種S180瘤株10 d的荷瘤小鼠，在無菌條件下抽取腹水，放入無菌容器內(nèi)，置冰塊保存。用0.4%臺盼藍(lán)生理鹽水液計數(shù)(其活細(xì)胞>95%)。用生理鹽水調(diào)細(xì)胞濃度至1×108/ml，備用。取昆明小鼠(雌雄各半)30只，將其隨機(jī)分為模型組、殼寡糖組(15 mg/ml)、環(huán)磷酰胺(CY)組，每組10只。各組均造模，每只小鼠右腋下皮下注射0.2 ml瘤細(xì)胞懸液制備動物模型。模型組用生理鹽水腹腔注射，每天0.02 ml/g；殼寡糖組用殼寡糖(15 mg/ml)給小鼠腹腔注射，每天0.02 ml/g；CY組于小鼠腹腔注射CY，每天20 mg/kg。各組小鼠均于接種后次日給藥，給藥1次/d，連續(xù)10 d。

1.2.2免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測P53、Bcl-2蛋白表達(dá) 脫頸椎處死小鼠，剝離腫瘤組織，10%甲醛固定，常規(guī)處理，石蠟包埋，連續(xù)組織切片4～6 μm，二甲苯脫蠟至水。免疫組化染色采用兩步法，其步驟嚴(yán)格按照試劑盒要求進(jìn)行。染色結(jié)果判定：Bcl-2和P53染色陽性標(biāo)志為棕黃色顆粒，Bcl-2主要表達(dá)在細(xì)胞核或胞質(zhì)，P53主要表達(dá)在胞質(zhì)。光鏡高倍鏡觀察，隨機(jī)選擇10個視野，計算1 000個細(xì)胞的陽性細(xì)胞數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠P53表達(dá)水平 與模型組(60.2±7.4)比較，殼寡糖組(46.5±6.9)和CY組(48.2±3.5)瘤組織中P53表達(dá)水平降低(P<0.05)；殼寡糖組與CY組比較無顯著差異(P>0.05)。見圖1。

2.2各組間小鼠Bcl-2表達(dá)水平測定 與模型組(73.6±8.0)比較，殼寡糖組(43.2±9.5)和環(huán)磷酰胺組(42.6±8.8)瘤組織中Bcl-2基因表達(dá)水平均降低(P<0.05)；殼寡糖組與CY組比較，兩者無顯著性差異(P>0.05)。見圖2。

圖1 各組小鼠P53表達(dá)水平(IH，×400)

圖2 各組小鼠Bcl-2表達(dá)水平(IH，×400)

3 討 論

在醫(yī)藥領(lǐng)域，殼寡糖主要用于抗腫瘤、抗感染、降低血清膽固醇等作用。在抗腫瘤方面，殼寡糖對小鼠S180肉瘤有明顯的抑制作用并能提高促凋亡基因Bax的表達(dá)，降低抑凋亡基因Bcl-2的表達(dá)〔5〕。殼寡糖還能提高小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬中性紅的能力〔6〕。本課題前期工作結(jié)果：殼寡糖可抑制腫瘤生長〔7〕，提高機(jī)體免疫功能，同時殼寡糖可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡〔8〕。

細(xì)胞凋亡是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主有序的死亡，又稱程序性細(xì)胞死亡(PCD)。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展不僅是細(xì)胞增殖和分化的異常，而且也與腫瘤細(xì)胞凋亡的失控密切相關(guān)。P53作為一種抑癌基因具有抑制腫瘤細(xì)胞凋亡和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的作用。Bcl-2 作為一種原癌基因無論是在生理和腫瘤形成的情況下, 均可以通過抑制細(xì)胞凋亡而促進(jìn)增殖細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤細(xì)胞的生長, 從而干預(yù)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本實驗結(jié)果說明殼寡糖能夠有效調(diào)節(jié)腫瘤組織P53、Bcl-2的表達(dá)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，延緩了腫瘤發(fā)生的進(jìn)程。

本實驗從P53、Bcl-2局部提示殼寡糖可影響腫瘤細(xì)胞的基因水平，而腫瘤是多基因異常所致疾病，殼寡糖抑制腫瘤生長在基因水平的作用是對上述基因特異的作用，或是對多種癌基因和抑癌基因非特異作用有待進(jìn)一步研究。

4 參考文獻(xiàn)

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6曹秀明，徐海嬌，尚 明，等.殼寡糖抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用的實驗研究〔J〕.哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2006;22(4):8-10.

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8官 杰,王 琪,王 慧,等.殼寡糖對荷瘤鼠腫瘤細(xì)胞凋亡的影響〔J〕.免疫學(xué)雜志,2009;25(2):195-7.