Survivin基因沉默對膀胱癌T24細(xì)胞增殖及對塞來昔布敏感性的影響

滕立新

(沈陽醫(yī)學(xué)院奉天醫(yī)院泌尿外科，遼寧 沈陽 110024)

膀胱癌可發(fā)生于膀胱的各層組織，發(fā)病率居泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤的首位〔1，2〕。研究發(fā)現(xiàn)膀胱癌的侵襲和轉(zhuǎn)移與多基因調(diào)控導(dǎo)致其表達(dá)產(chǎn)物改變有關(guān)〔3〕。本研究觀察siRNA對T24細(xì)胞凋亡的影響和對Survivin基因沉默的效率及Survivin基因被沉默后對腫瘤細(xì)胞周期及其對塞來昔布的敏感性的影響。

1 材料和方法

1.1主要材料 膀胱癌T24細(xì)胞株購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞究所。MI 1640培養(yǎng)液、胰蛋白酶和胎牛血清(美國Gibco公司)。Lipofectamine TM 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑和TRIzol(美國Invitrogen公司)；RT-PCR兩步法試劑盒(北京賽百盛基因技術(shù)有限公司)，cDNA合成試劑盒(日本TOYOBO公司)；AMV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(杭州博日)； siRNA基因片段由上海生工生物工程公司合成；G418(美國Klontech公司)；Survivin鼠抗人單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)；5%四甲基偶氮唑藍(lán)、HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗(北京中杉公司)；塞來昔布、流式細(xì)胞儀(COULTER XL;Coulter)；550酶標(biāo)儀(美國Biorad公司)，生物倒置顯微鏡(Olympus CKX4)。ECL試劑盒(美國Thermo公司)；RIPA蛋白裂解液(江蘇碧云天公司)。

1.2siRNA設(shè)計、合成及轉(zhuǎn)染 根據(jù)Genebank中 Survivin cDNA(Acc.No.U75285)的序列,通過相應(yīng)計算機(jī)軟件設(shè)計靶向Survivin mRNA 45～65序列，由21個堿基組成的核苷酸鏈,其序列為:5'-GG ACCACCGCAUCUCUACADTDT-3',同時合成互補(bǔ)鏈,經(jīng)退火形成雙鏈(dsRNA),即特異性 的siRNA分子，經(jīng)BLAST查詢,確定為Survivin特性序列,排除與其他基因的同源性。陰性對照 siRNA的序列為:5'-CGUACGCGGAAUACUUCG ADTDT-3',此序列不與人類任何基因序列同源。以上核苷酸分子均由上海生工生物工程公司合成。膀胱癌細(xì)胞株T24培養(yǎng)在含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，置飽和濕度5% CO2，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2天傳代1次，實驗時取對數(shù)生長期的細(xì)胞。按1× 105個/孔將膀胱癌T24細(xì)胞接種于24孔板中，至融合率達(dá)70%時以脂質(zhì)體法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。按基因轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染時分為三組：轉(zhuǎn)染pGenesil-1-Survivin-siRNA載體者為T24/Survivin-siRNA組(實驗組)，轉(zhuǎn)染隨機(jī)對照載體者為T24/control組(對照組)，未轉(zhuǎn)染的膀胱癌T24細(xì)胞為T24組(空白組)。于轉(zhuǎn)染后48 h行 RNA 干擾效應(yīng)的檢測。

1.3RT-PCR檢測 細(xì)胞棄培養(yǎng)液后磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，通過TRIzol法提取總RNA，用cDNA合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。分別擴(kuò)增Survivin和內(nèi)參GAPDH。Survivin引物序列:正義：5＇-CACCGCATCTCTACATTCAA-3＇，反義：5＇-CACTTTCTTCGCAGTTTCCT-3＇，擴(kuò)增產(chǎn)物為345 bp。GAPDH 正義：5＇-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3＇，反義：5＇-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3＇，擴(kuò)增產(chǎn)物為185 bp。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個循環(huán)。PCR產(chǎn)物采用2%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，使用凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行吸光度掃描并用Survivin吸光度/GAPDH吸光度值作為mRNA表達(dá)的相對強(qiáng)度。

1.4Western印跡檢測 細(xì)胞棄培養(yǎng)液后PBS沖洗3次，加入預(yù)冷的RIPA裂解液150 μl，RIPA裂解液預(yù)先加PMSF 1.5 μl使其終濃度為1 mmol/L。操作在冰上進(jìn)行，4℃下，10 000 r/min離心5 min后取上清液，通過BCA法測蛋白濃度后，99℃ 變性10 min。取50 μg蛋白行10%SDSPAGE電泳，通過電轉(zhuǎn)移印跡到(PVDF)膜上，封閉液中孵育1 h，加入1∶1 000稀釋的Survivin一抗，4℃過夜，TBST洗膜5 min,共3次，加入1∶5 000 HRP標(biāo)記的二抗和GAPDH,于37℃孵育2 h。PBS洗滌，采用ECL法檢測。

1.5流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期 收集三組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/L，冷PBS液洗滌2次,加入70%的冷乙醇(4℃)固定24 h后，洗滌細(xì)胞，與含10 μg/ml RNA 酶的Tris-HCl緩沖液(pH 7.4)共同孵育30 min。50 μg/ml碘化丙啶(PI)進(jìn)行細(xì)胞的DNA染色，1 h內(nèi)通過流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞的DNA含量分布，并計算出各個周期細(xì)胞所占的百分率。

1.6MTT檢測干擾Survivin后T24細(xì)胞對塞來昔布的敏感性 細(xì)胞轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒48 h后，收集轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染的T24細(xì)胞細(xì)胞，接種于96孔板 ，每個樣本做3個復(fù)孔，當(dāng)細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度的塞來昔布(2.5、5、10 、20 μmol/L)培養(yǎng)48 h；每孔加MTT 20 μl(濃度為5 mg/ml)，放置孵箱內(nèi)4 h后棄上清加入10%的十二烷基磺酸鈉(SDS)200 μl，過夜。震蕩15 min，用全自動酶標(biāo)儀(檢測490 nm處的吸光度值(A值)。抑制率(%)=(A對照-A實驗)/(A對照-A空白)×100%。

1.7平板克隆檢測干擾Survivin后T24對塞來昔布的敏感性 細(xì)胞轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒48 h后，收集轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染的T24細(xì)胞，接種于6孔板 ，每個樣本做3個復(fù)孔，細(xì)胞貼壁后，加入不 同濃度的塞來昔布(2.5、5、10 、20 μmol/L)培養(yǎng)中培養(yǎng)7 d，去除培養(yǎng)液，PBS洗2次，95%乙醇固定10 min，吉姆薩染液染色10 min，自來水沖洗后，晾干，通過Quantity One軟件計算克隆數(shù)。克隆形成抑制率(%)=1-(實驗組克隆數(shù)/對照組克隆數(shù))×100%。

2 結(jié) 果

2.1siRNA抑制Survivin mRNA的表達(dá) Survivin mRNA表達(dá)的RT-PCR檢測與對照組和空白組比較，實驗組條帶明顯變窄(P<0.05)。見圖1。

2.2siRNA抑制Survivin蛋白的表達(dá) Survivin蛋白表達(dá)的Western印跡檢測與對照組和空白組比較，T24/Survivin-siRNA組(實驗組)條帶明顯變窄(P<0.05)。見圖2。

2.3流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期 在G0/G1期實驗組較對照組和空白組略有增加，S期略有減少(P<0.05)，G2/M期細(xì)胞無明顯變化(P>0.05)，說明有明顯的S期阻滯。見表1。

Marker 空白組 對照組 實驗組

圖2 Western印跡檢測T24細(xì)胞中Survivin蛋白的表達(dá)

表1 siRNA抑制Survivin表達(dá)對T24細(xì)胞周期的影響

與空白組及對照組比較：1)P<0.05

2.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染后塞來昔布對T24細(xì)胞填殖抑制率 MTT法檢測結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染pgsiRNA-Survivin后，T24細(xì)胞對不同濃度的塞來昔布敏感性均提高 。隨著藥物濃度的增加，塞來昔布對細(xì)胞的抑制率也增加，呈現(xiàn)出劑量依賴性，實驗組細(xì)胞對不同濃度的塞來昔布敏感性顯著高對照組和空白組(P均<0.05)。見表2。

2.5細(xì)胞轉(zhuǎn)染后對T24細(xì)胞集落形成的影響 平板克隆檢測顯示，轉(zhuǎn)染 pgsiRNA-Survivin后，T24細(xì)胞對不同濃度的塞來昔布敏感性均提高，細(xì)胞克隆形成數(shù)明顯減少，克隆形成抑制率明顯增高(P<0.05 )。隨著藥物濃度的增加，塞來昔布對細(xì)胞的克隆形成抑制率也增加，呈現(xiàn)出劑量依賴性，實驗組細(xì)胞對不同濃度的塞來昔布克隆形成抑制率顯著高于對照組和空白組(P均<0.05 )。見表3。

表2 MTT法檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染后塞來昔布對T24細(xì)胞增殖的抑制率

表3 平板克隆檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染后塞來昔布對T24細(xì)胞克隆形成抑制率

3 討 論

膀胱癌高發(fā)年齡為50～69歲，男女比例為3∶4。膀胱癌病理與腫瘤的組織類型、細(xì)胞分化程度、生長方式和浸潤程度有關(guān)，其中以細(xì)胞分化和浸潤程度最為重要。膀胱癌的組織病理類型有90%以上為移行性細(xì)胞癌，其生物學(xué)行為復(fù)雜多變，易復(fù)發(fā)、浸潤和轉(zhuǎn)移〔4，5〕。膀胱癌細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移要經(jīng)歷一個多因素、多步驟、多階段的復(fù)雜過程,其中細(xì)胞轉(zhuǎn)移及侵襲是關(guān)鍵步驟。目前通過腫瘤特異性啟動子增強(qiáng)細(xì)胞中治療基因的轉(zhuǎn)錄選擇性是有效治療腫瘤的方法之一〔6，7〕。Survivin基因具有腫瘤組織表達(dá)特異性.在多數(shù)腫瘤組織中高表達(dá)，在癌旁組織及正常組織中無或低表達(dá)，是腫瘤基因治療理想的靶點(diǎn)。已有研究表明Survivin的表達(dá)與組織病理分級、臨床分期密切相關(guān)〔8〕。Survivin過表達(dá)會導(dǎo)致細(xì)胞加快向s期轉(zhuǎn)換，抑制G1期靜止，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。研究〔9〕顯示Survivin主要通過作用于各個凋亡途徑的交合點(diǎn)直接或間接抑制凋亡終末效應(yīng)器半胱氨酸蛋白酶Caspase-3及Caspase-7的活性來阻斷細(xì)胞的凋亡過程，使Caspase-3不能降解微管結(jié)構(gòu)蛋白，維持了紡錘體的完整性，可以確保胚胎細(xì)胞有絲分裂的順利進(jìn)行，而在腫瘤組織中Survivin過度表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞不斷分裂，惡性增殖永生化，使腫瘤持續(xù)生長。因此針對Survivin干預(yù)腫瘤生長有著很大的潛力。有研究證實Survivin在膀胱移行細(xì)胞癌組織中有高表達(dá)〔10〕。

塞來昔布是一種選擇性COX-2抑制劑，能抑制多種實體腫瘤細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔11～13〕。塞來昔布不僅對多種類型的腫瘤細(xì)胞均有抑制生長并誘導(dǎo)凋亡的作用，而且能夠增強(qiáng)化療藥物的抗腫瘤活性。塞來昔布使細(xì)胞的生存率降低，同時可激活Caspase級聯(lián)反應(yīng)，增加DNA的裂解,抑制Caspase-8的表達(dá)，從而誘導(dǎo)不同腫瘤細(xì)胞株的凋亡。

有資料〔14〕顯示，通過siRNA干擾誘導(dǎo)切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因(ERCC1)使Survivin表達(dá)下調(diào)可以增加膀胱癌等腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性。本實驗結(jié)果說明Survivin即可以直接有效降低細(xì)胞分裂增殖，也可以增加膀胱癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性，是重要的細(xì)胞凋亡因子，可以作為腫瘤基因治療的靶點(diǎn)。本實驗結(jié)果提示小分子Survivin干擾RNA沉默Survivin基因能夠增加膀胱癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性，可以為治療或輔助治療膀胱癌提供一個新的手段。

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