耐力訓(xùn)練對糖尿病糖脂代謝相關(guān)因子基因表達(dá)的影響

邵 月

(河南財(cái)經(jīng)政法大學(xué)體育部，河南 鄭州 450002)

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為，糖尿病(DM)是由于糖脂代謝紊亂誘發(fā)的“糖脂病”〔1〕。運(yùn)動(dòng)不但能夠提高胰島素敏感性，還可以通過獨(dú)立于胰島素之外的途徑促進(jìn)骨骼肌葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)和利用，對2型糖尿病(T2DM)的預(yù)防和治療具有一定的現(xiàn)實(shí)意義，如何有效促進(jìn)骨骼肌攝取和利用血糖也成為治療T2DM的一個(gè)新的研究方向。長期有規(guī)律運(yùn)動(dòng)對機(jī)體功能會(huì)產(chǎn)生良好的刺激和塑造作用。本研究選取代謝相關(guān)基因GLUT4、AMPKα2、PDK4和CPT-1β作為研究對象，在骨骼肌代謝酶基因轉(zhuǎn)錄水平上揭示病理?xiàng)l件下骨骼肌對長期耐力訓(xùn)練產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)適應(yīng)的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 2型糖尿病(T2DM)大鼠12只，約8周齡，體重(250±5)g，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司提供。自由飲食，環(huán)境溫度20℃～23℃，相對濕度50%～70%，自然光照。

1.2主要試劑與儀器 總RNA提取試劑Trizol購自Invitrogen；cDNA第一鏈合成試劑購自Promega；SYBR green PCR Master Mix購自TO YOBO(上海東洋紡)。Real-time PCR儀：Applied Biosystem StepOne型；離心機(jī)：Eppendorf 5804/R型。

1.3動(dòng)物分組及運(yùn)動(dòng)方案 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后隨機(jī)分為安靜組(GKC)、耐力訓(xùn)練組(GKE)。跑臺訓(xùn)練6 w，速度≤16.7 m/min，訓(xùn)練時(shí)段18∶30～22∶00，周日停訓(xùn)1次。

1.4取材 末次訓(xùn)練后24～48 h內(nèi)大鼠斷頸處死，20 min內(nèi)分別取完整的左右下肢腓腸肌，切分若干份后置于液氮中速凍，-80℃超低溫冰箱保存，待檢測。

1.5熒光定量PCR檢測GLUT4、AMPKα2、PDK4和CPT-1β的基因轉(zhuǎn)錄

1.5.1骨骼肌RNA的提取和鑒定 取腓腸肌樣品約100 mg進(jìn)行RNA抽提，選取質(zhì)量和純度符合RT-PCR要求的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

1.5.2逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 取9.5 μl總RNA以oligo dT為引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和cDNA合成。反應(yīng)條件:37℃，50 min；70℃，10 min；冰上放置5 min，分成若干份-20℃儲(chǔ)存，備用。

1.5.3擴(kuò)增引物 見表1。

1.5.4熒光定量PCR cDNA樣品按以下反應(yīng)體系進(jìn)行:2×SYBR green PCR MasterMix 10 μl，上游引物1 μl，下游引物1 μl，ddH 204 μl，模板cDNA 4 μl，總體積20 μl。反應(yīng)結(jié)束后，PCR儀給出各反應(yīng)孔的Ct值，以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參，根據(jù)公式2-ΔCt計(jì)算各樣品目的基因的相對表達(dá)量。

表1 用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR的引物序列

2 結(jié) 果

如表2所示，GK大鼠耐力組AMPKα2 mRNA轉(zhuǎn)錄顯著高于GK安靜組(P<0.01)，但GLUT4 mRNA轉(zhuǎn)錄沒有顯著性差異(P>0.05)，PDK4 mRNA表達(dá)顯著性降低(P<0.05)，CPT-1β mRNA轉(zhuǎn)錄沒有顯著性差異(P>0.05)。

表2 耐力訓(xùn)練對GK大鼠骨骼肌AMPKα2、GLUT4、PDK4和CPT-1β基因轉(zhuǎn)錄的影響

3 討 論

腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)是一種重要的代謝應(yīng)激敏感性蛋白激酶，不僅參與糖、脂肪和蛋白質(zhì)的代謝調(diào)節(jié)，還對基因轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控的因子以及多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的分子產(chǎn)生影響〔2〕。AMPKα2是AMPK最為重要的催化亞基，對于骨骼肌葡萄糖攝取具有重要意義，AMPKα2缺陷會(huì)增加罹患胰島素抵抗(IR)和T2DM的風(fēng)險(xiǎn)〔3〕。吳毅等〔4〕研究發(fā)現(xiàn)，T2DM大鼠骨骼肌AMPK的表達(dá)和磷酸化受損，本研究說明T2DM大鼠骨骼肌AMPKα2 mRNA轉(zhuǎn)錄對耐力訓(xùn)練非常敏感，耐力訓(xùn)練能夠逆轉(zhuǎn)已經(jīng)受損的AMPK基因表達(dá)，應(yīng)該是一種較好的運(yùn)動(dòng)適應(yīng)，對改善DM進(jìn)程有益。

葡萄糖跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)是主要限速步驟〔5〕，GLUT4是骨骼肌最重要的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體〔6〕。運(yùn)動(dòng)可直接影響GLUT4的基因表達(dá)，對于葡萄糖代謝失常和T2DM患者，可以改善身體血糖控制能力〔7〕，有規(guī)律運(yùn)動(dòng)似乎是最佳的天然基因療法。王丹等〔8〕發(fā)現(xiàn)，12 w游泳訓(xùn)練可以使T2DM大鼠股四頭肌GLUT4 mRNA表達(dá)增加。結(jié)合AMPKα2水平來看，耐力運(yùn)動(dòng)可能極大增加了AMPKα2水平，繼而傳遞信號給GLUT4，使其隨之大量增加，并促使更多的GLUT4移向細(xì)胞膜表面來轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖。由此可見耐力運(yùn)動(dòng)對于葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力具有很大的改善作用，是一種非常好的運(yùn)動(dòng)適應(yīng)。

丙酮酸脫氫酶復(fù)合體(PDC)緊密聯(lián)系糖酵解和氧化磷酸化過程，對有氧代謝過程至關(guān)重要〔9〕。PDK通過磷酸化過程滅活丙酮酸脫氫酶，IR或T2DM患者骨骼肌PDK4蛋白表達(dá)增加〔10〕。胰島素能通過磷酸肌醇3激酶通路抑制PDK4表達(dá)，DM患者糖皮質(zhì)激素分泌增加，啟動(dòng)并激活PDK4基因表達(dá)〔11〕。在T2DM動(dòng)物的胰腺β細(xì)胞PDC活性顯著降低。高血糖、高血脂上調(diào)PDK mRNA降低了PDH活性〔12〕。PPAR-α是脂質(zhì)儲(chǔ)存和分解代謝的重要調(diào)節(jié)因子〔13〕，PDK4是PPAR-α的主要靶點(diǎn)。高脂環(huán)境下，游離脂肪酸可激活PPAR-α，增加PDK的表達(dá)滅活PDC，減少乙酰輔酶A的生成，從而影響葡萄糖代謝過程。腫瘤細(xì)胞丙酮酸進(jìn)入線粒體三羧酸循環(huán)通路障礙，產(chǎn)生“瓦氏效應(yīng)”現(xiàn)象，其與線粒體PDK活性較高有關(guān)〔14〕。本研究發(fā)現(xiàn)耐力訓(xùn)練使DM大鼠PDK4 mRNA顯著下降，這是DM大鼠對耐力訓(xùn)練產(chǎn)生的一種良好的運(yùn)動(dòng)適應(yīng)。PDK mRNA水平下降減弱了PDK對PDC的抑制，促進(jìn)了乙酰輔酶A的生成，對葡萄糖的完全氧化供能有利，是運(yùn)動(dòng)改善DM癥狀的一種分子水平上的依據(jù)。

脂質(zhì)調(diào)節(jié)因子CPT-1在運(yùn)動(dòng)改善血脂中發(fā)揮著積極作用。張明等〔15〕研究發(fā)現(xiàn)8 w有氧運(yùn)動(dòng)后高脂飲食小鼠骨骼肌PPARα及CPT-1mRNA表達(dá)有所提高。張玥等〔16〕研究也證實(shí)，運(yùn)動(dòng)能提高肝臟中PPARα、CPT-1表達(dá)量促進(jìn)脂肪酸的利用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明此時(shí)耐力訓(xùn)練促進(jìn)長鏈脂肪酸進(jìn)入線粒體氧化的能力有限，可能DM大鼠并沒有啟用最經(jīng)濟(jì)、最能源節(jié)省化的供能方式，仍然以葡萄糖氧化為主供能。實(shí)際上，本實(shí)驗(yàn)在進(jìn)行耐力訓(xùn)練時(shí)還是有一定運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度的，不可能完全依賴脂肪酸氧化供能，糖原供能仍然存在。但耐力訓(xùn)練比較復(fù)雜，諸多客觀因素都會(huì)影響機(jī)體代謝狀態(tài)，所以本實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象仍然需要進(jìn)一步研究。

綜上，6 w耐力運(yùn)動(dòng)干預(yù)可能通過能量敏感性通路AMPK-GLUT4葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制極大地促進(jìn)骨骼肌糖攝取能力，對改善DM大鼠高血糖癥狀有利。耐力訓(xùn)練能在一定程度上逆轉(zhuǎn)T2DM大鼠骨骼肌AMPK磷酸化受損狀況，可能對改善T2DM疾病進(jìn)程有一定益處。PDK4水平下降減弱了PDK對PDC的抑制，促進(jìn)了乙酰輔酶A生成，對葡萄糖的完全氧化供能有利，是運(yùn)動(dòng)改善DM癥狀的又一分子水平上的依據(jù)。耐力訓(xùn)練對CPT-1β水平并沒有產(chǎn)生顯著性影響，說明此時(shí)DM大鼠可能仍以葡萄糖氧化為主供能。

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