民族藥復方美登木片微生物限度檢查結(jié)果與分析

1.普洱市民族傳統(tǒng)醫(yī)藥研究所,云南 普洱 665000;2.普洱市食品藥品檢驗所,云南 普洱 665000

民族藥復方美登木片微生物限度檢查結(jié)果與分析

付開聰1趙琪忠2

1.普洱市民族傳統(tǒng)醫(yī)藥研究所,云南 普洱 665000;2.普洱市食品藥品檢驗所,云南 普洱 665000

微生物限度檢查是用于判斷非規(guī)定滅菌制劑及原料、輔料是否符合藥典規(guī)定和指導研發(fā)制劑、原料、輔料微生物質(zhì)量標準的依據(jù)。筆者就民族藥復方美登木片研發(fā)過程中微生物限度檢查驗證的結(jié)果作一分析,以供同行參考。

傣族拉祜族藥;復方美登木片;微生物限度檢查

復方美登木片是普洱市民族傳統(tǒng)醫(yī)藥研究所在挖掘整理民族民間醫(yī)藥過程中，篩選出來的民族藥驗方。源于傣族方記《檔哈雅帕雅摩雅召片領(lǐng)景帕罕》(傣族宮庭內(nèi)土司醫(yī)生扎康郎香的醫(yī)書——宮廷秘方集)，應(yīng)用歷史達500多年(此書未整理出版)。經(jīng)臨床觀察與驗證，此方具有軟堅散結(jié)，消腫止痛的功效。目前，已成當?shù)匕傩占盎颊哂糜谥委熑橄傩∪~增生、前列腺增生及癌癥化療后的輔助用藥。此藥不僅療效較好，成本低廉，而且來自于民間，起源于古代，深得百姓、患者和醫(yī)生的親睞，值得深入研究。

1 復方美登木片微生物限度檢驗方法步驟

1.1 陽性對照菌液的制備

1.1.1 試驗菌種 大腸埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B)44102]

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B)26003]

枯草芽孢桿菌(Bacilus subtilis)[CMCC(B)63501]

白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F)98001]

1.1.2 對照菌液 上述陽性菌分別接種于相應(yīng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)一定時間，取培養(yǎng)物用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋成每1ml含菌數(shù)約為50～100cfu的陽性對照菌液備用。

1.2 細菌計數(shù)方法驗證(常規(guī)法)

1.2.1 陽性對照菌液組 取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌,、枯草芽孢桿菌對照液分別注入平皿(每種2個平皿)，傾注培養(yǎng)基培養(yǎng)后計數(shù)，結(jié)果見表1。

1.2.2 供試品組 取復方美登木片(批號：090401)1∶10、1∶100、1∶1000的供試液各1ml 分別注入平皿(每個稀釋級2個平皿)傾注培養(yǎng)基培養(yǎng)后計數(shù)。結(jié)果見表1。

1.2.3 試驗組(供試品加陽性對照菌液組) 取復方美登木片(批號：090401)1∶10、1∶100、1∶1000的供試液各1ml 分別注入平皿(每個稀釋級2個平皿)分別加入大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌對照菌液1ml，傾注培養(yǎng)基培養(yǎng)后計數(shù)。結(jié)果見表1。

2 霉菌及酵母菌計數(shù)方法的驗證(常規(guī)法)

2.1 陽性對照菌液組 取白色念珠菌液各1ml分別注入平皿(2個平皿)，傾注培養(yǎng)基培養(yǎng)后計數(shù)，結(jié)果見表1。

2.2 供試品組 取復方美登木片(批號：090401)1∶10、1∶100、1∶1000的供試液各1ml 分別注入平皿(每個稀釋級2個平皿)傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，混勻后25℃培養(yǎng)72h,計數(shù)，結(jié)果見表1。

2.3 試驗組(供試品加陽性對照菌液組) 取復方美登木片(批號：090401)1∶10、1∶100、1∶1000的供試液各1ml 分別注入平皿(每個稀釋級2個平皿)分別加入白色念珠菌對照菌液1ml，傾注培養(yǎng)基培養(yǎng)后計數(shù)。結(jié)果見表1。

表1 復方美登木片細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法驗證表(常規(guī)法)

回收率(%)=(實驗組平均菌落數(shù)-供試品對照組平均菌落數(shù))÷菌液組的平均菌落數(shù)(%)

3 細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)法的驗證(培養(yǎng)基稀釋法)

通過以上對細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)法(常規(guī)法)的驗證，可看出1∶10、1∶100、1∶1000的供試液對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌均有抑菌作用，但通過稀釋就可以降低抑菌活性，故擬先用培養(yǎng)基稀釋法，并對該法進行方法學驗證。

3.1 陽性對照菌液制備

3.1.1 試驗菌種 大腸埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B)44102]

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B)26003]

枯草芽孢桿菌(Bacilus subtilis)[CMCC(B)63501]

白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F)98001]

3.1.2 對照菌液 取經(jīng)30～35℃培養(yǎng)18～24h的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌與枯草芽孢桿菌肉湯液體培養(yǎng)物1ml加入9ml 0.9%無菌氯化鈉溶液中，10倍稀釋至10-5～10-7約為50～100cfu/ml備用。

取經(jīng)23～28℃培養(yǎng)24～48h的白色念珠菌霉菌液體培養(yǎng)物1ml，加入9ml 0.9%無菌氯化鈉溶液中，10倍稀釋至10-5～10-7約為50～100cfu/ml備用。

3.2 陽性對照菌液組 取對照菌液各1ml，分別注入平皿(5個平皿)，傾注培養(yǎng)基培養(yǎng)后計數(shù)，結(jié)果見表2。

表2-1 細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法驗證表(培養(yǎng)基稀釋法)(批號：090401)

3.2.1 供試品組 取1∶1000的供試液1ml等量分別注入5個平皿(每平皿0.2ml)，傾注肉湯瓊脂培養(yǎng)基34℃培養(yǎng)48h后計數(shù)，結(jié)果見表2。

3.2.3 試驗組(供試品組加陽性菌液組) 取1∶1000供試液1ml等量分別注入5個平皿(每平皿0.2ml),共3個批次，分別加入大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌對照菌液各1ml，傾注肉湯瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)48h，計數(shù)，結(jié)果見表2。

表2-2 細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法驗證表(培養(yǎng)基稀釋法)(批號：090402)

表2-3 細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法驗證表(培養(yǎng)基稀釋法)(批號：090403)

從以上結(jié)果看出稀釋法消除了本品對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌的抑菌作用，可采用此方法對復方美登木片進行微生物限度的細菌數(shù)檢查。

3.3 控制菌檢查方法的驗證 取本品10g，加pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液制成1∶10的供試液備用。

3.4 陽性對照菌液的制備

3.4.1 實驗菌種 大腸埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B)44102]

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B)26003]

3.4.2 對照菌液 取經(jīng)30～35℃培養(yǎng)18～24h的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌1ml加入9ml 0.9%無菌氯化鈉溶液中，10倍稀釋至10-5～10-7約為50～100cfu/ml備用。

表3 對照菌液計數(shù)

3.5 大腸埃希菌檢查法的驗證(培養(yǎng)基稀釋法)

3.5.1 試驗組 取以上1∶10的供試液10ml加入100ml無菌膽鹽乳糖培養(yǎng)基中,加入大腸埃希菌對照菌液1ml培養(yǎng)后取該培養(yǎng)物做MUG及靛基質(zhì)試驗。結(jié)果均為陰性，未檢出大腸埃希菌。

3.5.2 陰性菌對照組 取以上1∶10的供試液10ml加入100ml無菌膽鹽乳糖培養(yǎng)基中,加入金黃色葡萄球菌對照菌液1ml培養(yǎng)后取該培養(yǎng)物做MUG及靛基質(zhì)試驗。結(jié)果均為陰性，未檢出陰性對照菌。

3.5.3 供試品組 取以上1∶10的供試液10ml加入100ml無菌膽鹽乳糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)后取該培養(yǎng)物做MUG及靛基質(zhì)試驗。結(jié)果均為陰性，未檢出大腸埃希菌。

3.5.4 試驗組 取以上1∶1000的供試液2ml加入100ml無菌膽鹽乳糖培養(yǎng)基中,加入大腸埃希菌對照菌液1ml培養(yǎng)后取該培養(yǎng)物做MUG及靛基質(zhì)試驗。結(jié)果均為陽性，檢出大腸埃希菌。

4 結(jié)果分析與建議

在中藥制劑生產(chǎn)過程中，原料本身是帶菌者，而且生產(chǎn)周期長，處理繁鎖，又增加了染菌的機會，中成藥中含糖、淀粉、微量元素等營養(yǎng)成份較多，為微生物生長提供了有利條件。因此藥品的染菌并非偶然，只有在取得相應(yīng)的預(yù)防性措施之后，才能減少或避免污染。

生產(chǎn)單位及生產(chǎn)部門應(yīng)加強對藥品受微生物污染的危害性及控制藥品微生物限度重要性的認識和學習，切實改善措施嚴格控制生產(chǎn)品質(zhì)量；加強原料藥及輔料的合理處理和滅菌，特別是含生藥原粉的制劑更應(yīng)加強處理，美登木生產(chǎn)中就有重樓以生婁入藥，在投原料前應(yīng)進行逐項檢查驗收，防止蟲蛀、霉變、腐爛原料進入生產(chǎn)；滅菌處理應(yīng)根據(jù)藥物有效成份的穩(wěn)定性嚴格控制溫度及時間；重視配料容器、用具及包裝材料的處理(消毒或滅菌)，已潔凈的應(yīng)有預(yù)防再污染的方法及措施；提高工作人員的素質(zhì)，加強無菌觀念，工作中嚴格遵守操作規(guī)程，養(yǎng)成良好的衛(wèi)生習慣；健全質(zhì)量檢驗機制，嚴格遵守檢驗程序，半成品檢驗不合格的，決不流到下一工序；成品檢驗不合格，決不出廠；改善倉儲條件及運輸條件，嚴防成品的再污染。

R29

A

1007-8517(2014)20-0014-03

2014.09.01)