鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥基因及插入序列遺傳標(biāo)記的研究

曹曉君 李小燕

[摘要] 目的 通過(guò)對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥基因和插入序列遺傳標(biāo)記進(jìn)行研究來(lái)了解鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥機(jī)制，為臨床治療性用藥、提供臨床療效提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法 通過(guò)細(xì)菌藥物敏感試驗(yàn)檢測(cè)鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)抗菌藥物的耐藥情況，通過(guò)PCR方法檢測(cè)鮑曼不動(dòng)桿菌的攜帶β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物耐藥基因的狀況以及插入序列遺傳標(biāo)記的情況。 結(jié)果 細(xì)菌藥物敏感試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果是鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)多種抗菌藥物均耐藥，共檢出TEM、OXA-2、ADC、CTX-M-1、CTX-M-2、IMP、OXA-24等耐藥基因，插入序列遺傳標(biāo)記ISabal、IS26、tnp513檢出率分別為80.43%和47.82%、52.17%。 結(jié)論 β-內(nèi)酰胺酶基因廣泛存在于鮑曼不動(dòng)桿菌中，是鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)目前臨床常用的β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物存在多重耐藥的主要原因。多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥性與插入序列遺傳標(biāo)記有一定的相關(guān)性。

[關(guān)鍵詞] 鮑曼不動(dòng)桿菌；多重耐藥；β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物；插入序列

[中圖分類(lèi)號(hào)] R446.5???[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B???[文章編號(hào)] 2095-0616（2014）11-122-05

A study on drug resistance gene and genetic markers of insertion sequence of acinetobacter baumannii

CAO?Xiaojun??LI?Xiaoyan

Clinical Laboratory,the Fourth Affiliated Hospital of GZMU,Guangzhou 511447,China

[Abstract] Objective To study the drug resistance gene and genetic markers of insertion sequence of acinetobacter baumannii,so as to understand the resistance mechanisms of acinetobacter baumannii and provide experimental evidence for clinical medication and clinical curative effect. Methods Drug sensitivity tests were carried out to test the drug resistance of acinetobacter baumannii towards anti-bacterial drugs. PCR was applied to test the drug resistance gene of β-lactam antibiotics carried by acinetobacter baumannii as well as test the genetic markers of insertion sequence. Results The results of drug sensitivity tests showed that acinetobacter baumannii is resistant to various kinds of anti-bacterial drugs.Drug resistance genes,such as TEM,OXA-2,ADC,CTX-M-1,CTX-M-2,IMP- OXA-24,were detected,and the detection rates of genetic marks of insertion sequence, including Isabal, IS26 and tnp513,were 80.43%,47.82% and 52.17% respectively. Conclusion β-lactamase gene is widely distributed in acinetobacter baumannii,which explains the main reason why acinetobacter baumannii has multi-drug resistance towards clinically commonly used β-lactam antibiotics.The drug resistance of acinetobacter baumannii has a certain correlation with the genetic markers of insertion sequence.

[Key words] Acinetobacter baumannii;Multi-drug resistance;β-lactam antibiotics;Insertion sequence

鮑曼不動(dòng)桿菌（acinetobacter baumannii，A baumannii），常寄居于人體的皮膚、口腔黏膜、呼吸道、泌尿道及自然界的水和土壤中，是惟一能在人類(lèi)皮膚表面生存的革蘭陰性桿菌，是醫(yī)院感染的一種重要病原菌。該菌生存能力強(qiáng)，對(duì)消毒劑敏感率低，對(duì)抗生素耐藥率高，極易播散流行，主要引起獲得性肺炎，尤其是呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎、尿路感染、菌血癥、創(chuàng)口感染、繼發(fā)性腦膜炎等，嚴(yán)重危害患者健康，給臨床治療帶來(lái)極大困難。越來(lái)越多的由鮑曼不動(dòng)桿菌引起的感染被報(bào)道，特別是多重耐藥菌株引起的感染被越來(lái)越多的專(zhuān)家所關(guān)注[1-3]。本課題以多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌為研究對(duì)象，了解其對(duì)臨床常用抗生素的耐藥情況及其可能的耐藥基因，并對(duì)插入序列遺傳標(biāo)記在細(xì)菌耐藥中的作用進(jìn)行分析。旨在通過(guò)對(duì)多耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥機(jī)制的探究，為臨床用藥治療多耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌起到一定的指導(dǎo)作用，同時(shí)也為開(kāi)發(fā)新的抗菌藥物和發(fā)現(xiàn)新菌種拓展思路。

1?材料與方法

1.1?菌株來(lái)源

全部菌株來(lái)源于我院2013年1～12月臨床住院患者的痰液、腦脊液、尿液及血液等不重復(fù)標(biāo)本中分離的鮑曼不動(dòng)桿菌，共46株，所有的細(xì)菌經(jīng)VITEK-2自動(dòng)鑒定系統(tǒng)（BioMerieux）確認(rèn)。

1.2?實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

1.2.1?實(shí)驗(yàn)儀器?包括VITEK2-compact全自動(dòng)微生物鑒定儀鑒定（法國(guó)生物梅里埃公司）、PCR擴(kuò)增儀（Appiled Biosystem））、水平凝膠電泳儀（Bio-Rad）、凝膠成像及分析系統(tǒng)（北京賽智公司）、全自動(dòng)ABl3070DNA測(cè)序儀（美國(guó)ABI公司）、低溫冰箱（Thermo）、超純水分離系統(tǒng)（Pall）、低溫臺(tái)式高速離心5810R（Eppendorf公司）等。

1.2.2?實(shí)驗(yàn)試劑?包括（1）藥敏紙片、M-H瓊脂（英國(guó)OXOID公司）；（2）TaqDNA聚合酶、dNTPs、蛋白酶K、瓊脂糖（日本TaKaRa公司）；（3）引物合成（上海生工生物有限公司）；（4）DNA分子量Marker（Fements公司）等。

1.3?方法

1.3.1?菌株鑒定?標(biāo)本的采集與細(xì)菌分離培養(yǎng)嚴(yán)格按《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》[4]進(jìn)行。采用法國(guó)生物梅里埃公司VITEK2-compact進(jìn)行菌株鑒定。

1.3.2?藥物敏感試驗(yàn)?采用K-B紙片擴(kuò)散法測(cè)定鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)抗菌藥物的敏感性。參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）2010年的標(biāo)準(zhǔn)判斷結(jié)果。12種抗菌藥物分別為頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢吡肟、頭孢西丁、亞胺培南、美洛培南、氨芐西林/舒巴坦、阿莫西林/克拉維酸、阿米卡星、慶大霉素、環(huán)丙沙星和四環(huán)素。藥敏試驗(yàn)質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922。

1.3.3?制備DNA?將經(jīng)過(guò)全自動(dòng)細(xì)菌鑒定藥敏分析系統(tǒng)鑒定后的鮑曼不動(dòng)桿菌轉(zhuǎn)入血平板，經(jīng)24h培養(yǎng)后，挑純培養(yǎng)菌落置入0.5mL離心管內(nèi)（內(nèi)預(yù)置200ng/mL蛋白酶K溶液200μL），充分震蕩混勻后進(jìn)行2h水?。?6℃），然后放入95℃水浴進(jìn)行10min，離心半徑15000r/min進(jìn)行30s離心，獲得的上清液作為基因檢測(cè)的DNA模板液，放入-20℃冰箱內(nèi)進(jìn)行保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4?隨機(jī)引物PCR擴(kuò)增選用隨機(jī)引物ERICIR（5-ATGTA-AGCTCCTGGGGATTCAC-3）和ERIC2（5-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3）進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增，在PCR反應(yīng)擴(kuò)增完成后在1.5%的瓊脂糖凝膠中放入PCR產(chǎn)物，150V電泳20min后用凝膠成像儀觀察DNA條帶的分布并分析基因型。

1.3.5?擴(kuò)增引物?應(yīng)用上海生工生物工程有限公司合成的基因擴(kuò)增引物[5]，各種靶基因引物序列和目的產(chǎn)物長(zhǎng)度見(jiàn)表１。

1.3.6?基因檢測(cè)?均為PCR法檢測(cè)。PCR擴(kuò)增體系為：每反應(yīng)體系Pl、P2引物各lμmol/L，dNTPs各2μL KCL 10mmol/L，（NH4）2SO4是8mmol/L，

表1??PCR引物序列

擴(kuò)增基因

名稱(chēng) 引物序列（5→3） 產(chǎn)物長(zhǎng)度

（bp）

TEM F TTCGTGTCGCCCTTATTC 535

R TTCGTGTCGCCCTTATTC

SHV F TGCGCAAGCTGCTGACCAGC 305

R TTAGCGYTGCCAGTGCTCGA

OXA-1 F CTGTTGTTTGGGTTTCGCAAG 440

R CTTGGCTTTTATGCTTGATG

OXA-2 F CAGGCGCYGTTCGYGATGAGTT 233

R GCCYTCTATCCAGTAATCGCC

OXA-10 F GTCTTTCRAGTACGGCATTA 822

R GATTTTCTTAGCGGCAACTTA

OXA-20 F TTGATAATCCGATTTCTAGCAC 801

R CTAGTTGGGTGGCAAAGCAT

PER F AGTCAGCGGCTTAGATA 978

R CGTATGAAAAGGACAATC

VEB F GCGGTAATTTAACCAGA 961

R GCCTATGAGCCAGTGTT

GES F ATGCGCTTCATTCACGCAC 846

R CTATTTGTCCGTGCTCAGG

CARB F AAAGCAGATCTTGTGACCTATTC 588

R TCAGCGCGACTGTGATGTATAAAC

CTX-M-1 F ATGGTTAAAAAATCACTGCGYCAGTTC 876

R TCACAAACCGTYGGTGACGATTTTAGCCGC

CTX-M-2 F ATGATGACGCAGAGCATTCGCCGCTCA 876

R TCAGAAACCGTGGGTTACGATTTTCGC

CTX-M-9 F ATGATGAGACATCGCGTTAAGCGG 876

R TTAATAACCGTCGGTGACGATTTTCGCG

IMP F CGGCCKCAGGAGMGKCTTT 587

R AACCAGTTTTGCYTTACYAT

ADC F GGTATGGCYGTGGGBGTYATTC 739

R CTAAGASTTGGTCRAARGGT

DHA F AACTTTCACAGGTGTGCTGGGT 405

R CCGTACGCATACTGGCTTTGC

OXA-24群 F CAAGAGCTTGCAAGACGGACT 420

R TCCAAGATTTTCTAGCRACTTATA

ISabal P1：AATGATTGGTGACAATGAAG 372

P2：ATGCAGCGCTTCTTTGCAGG

IS26 P1：ATGAACCCATTCAAAGGCCGGCAT 387

P2：CCGTCGTAACAGCAAAGCTGCATA

Tnp513 P1：ATGTCGCTGGCAAGGAACGC 240

P2：GGGTTCGCTGCGAGGATTGT

MgCL22mmol/L，Tris-HCL（pH9.0）10mmol/L，NP400.5%，BSA0.02%，Taq DNA pol 1U?？偡磻?yīng)體積20μL（其中模板液5μL）。PCR擴(kuò)增熱循環(huán)參數(shù)為：93℃預(yù)變性2min，然后94℃60s、55℃45s、72℃60s，以上反應(yīng)循環(huán)35個(gè)周期，最后一個(gè)周期時(shí)72℃延長(zhǎng)2min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳（110V）20min后在紫外凝膠電泳成像儀下觀察，并記錄結(jié)果。

1.3.7?耐藥基因序列分析取PCR產(chǎn)物在美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司提供的ABl3730型毛細(xì)管全自動(dòng)測(cè)序儀上進(jìn)行測(cè)序，由上海生工生物工程有限公司協(xié)助完成。

2?結(jié)果

2.1?藥物敏感試驗(yàn)的結(jié)果

46株鮑曼不動(dòng)桿菌中對(duì)12種抗生素耐藥率為69.57%~100.00%，全部鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)頭孢噻肟、慶大霉素和環(huán)丙沙星耐藥，對(duì)全部的抗生素均耐藥的31株，對(duì)第三、四代頭孢菌素的耐藥率最低為89.13%，對(duì)美羅培南和亞胺培南的耐藥率最低為69.57%。46株鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)抗菌藥物的耐藥性見(jiàn)表2。

表2??鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)抗菌藥物的耐藥性

抗菌藥物 敏感株數(shù) 耐藥株數(shù) 耐藥率（％）

頭孢噻肟 0 46 100.00

頭孢他啶 4 42 91.30

頭孢吡肟 5 41 89.13

頭孢西丁 2 44 95.65

亞胺培南 14 32 69.57

美洛培南 12 34 73.91

氨芐西林/舒巴坦 9 37 80.43

阿莫西林/克拉維酸 10 36 78.26

阿米卡星 3 43 93.48

慶大霉素 0 46 100.00

環(huán)丙沙星 0 46 100.00

四環(huán)素 1 45 97.83

2.2?基因檢測(cè)結(jié)果

46株鮑曼不動(dòng)桿菌β-內(nèi)酰胺酶的基因PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，TEM、OXA-2、ADC、CTX-M-1、CTX-M-2、IMP、OXA-24、ADC均為陽(yáng)性。TEM陽(yáng)性45株，陽(yáng)性率97.83%（45/46）；OXA-2陽(yáng)性42株，陽(yáng)性率91.30%（42/46）；ADC陽(yáng)性46株，陽(yáng)性率100%（46/46）；CTX-M-1陽(yáng)性42株，陽(yáng)性率91.30%（42/46）；CTX-M-2陽(yáng)性44株，陽(yáng)性率95.65%（44/46）；IMP陽(yáng)性43株，陽(yáng)性率93.48%（43/46）；OXA-24陽(yáng)性44株，陽(yáng)性率95.65%（44/46）；ADC陽(yáng)性42株，陽(yáng)性率91.30%（42/46）。對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌PCR產(chǎn)物隨機(jī)進(jìn)行序列測(cè)試，并在國(guó)際互聯(lián)網(wǎng)上對(duì)結(jié)果進(jìn)行檢索分析證明基因測(cè)序結(jié)果與Genbank的序列一致。

2.3?插入序列遺傳標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果

46株鮑曼不動(dòng)桿菌的插入序列遺傳標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果為插入序列遺傳標(biāo)記ISabal、IS26、tnp513檢出率分別為80.43%和47.82%、52.17%。PCR陽(yáng)性產(chǎn)物測(cè)得序列經(jīng)BLAST比對(duì)，與已在GenBank登錄的序列均相同。見(jiàn)圖1～3。

圖1??ISabal基因部分測(cè)序圖

圖2??IS26基因部分測(cè)序圖

圖3??tnp513基因部分測(cè)序圖

3?討論

鮑曼不動(dòng)桿菌是醫(yī)院獲得性感染的重要病原菌之一[6-8]。該菌生存能力強(qiáng)，對(duì)消毒劑敏感率低，對(duì)抗生素耐藥率高，極易播散流行。目前，鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥情況已經(jīng)十分嚴(yán)峻[9-12]。1991年美國(guó)報(bào)道了對(duì)碳青霉烯類(lèi)藥物耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌稱(chēng)之為全球性的標(biāo)志性事件，之后在世界各地不斷出現(xiàn)。鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥株不斷增多，對(duì)臨床常用的抗菌藥物出現(xiàn)多重耐藥性，使臨床的感染率和死亡率不斷上升，給抗生素臨床應(yīng)用帶來(lái)了極大的困難，給臨床感染性疾病的治療帶來(lái)極大的困難[13]。因此，了解它的流行現(xiàn)狀、致病性、藥物敏感性及耐藥機(jī)制，對(duì)于指導(dǎo)臨床治療顯得非常重要。本組藥物敏感結(jié)顯示，46株鮑曼不動(dòng)桿菌中對(duì)12種抗生素耐藥率為69.57%~100%，全部鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)頭孢噻肟、慶大霉素和環(huán)丙沙星耐藥，對(duì)全部的抗生素均耐藥的31株，對(duì)第三、四代頭孢菌素的耐藥率最低為89.13%，對(duì)美羅培南和亞胺培南的耐藥率最低為69.57%。結(jié)果提示：鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)多種抗生素呈現(xiàn)多重重度耐藥，對(duì)機(jī)體的危害形勢(shì)比較嚴(yán)峻。臨床治療鮑曼不動(dòng)桿菌所致的感染性疾病時(shí)應(yīng)注意根據(jù)藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果選擇敏感的抗生素以提高臨床療效，同時(shí)降低抗生素不當(dāng)應(yīng)用所導(dǎo)致的鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥性。

鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥機(jī)制[4-16]極其復(fù)雜，其耐藥的生化機(jī)制主要包括產(chǎn)生金屬氨基糖甙類(lèi)藥物修飾酶、β-內(nèi)酰胺酶、青霉素結(jié)合蛋白的改變和外排泵出機(jī)制、代謝途徑的改變、外膜蛋白的丟失或膜孔蛋白的缺損等。這些細(xì)菌耐藥生化機(jī)制的產(chǎn)生，主要是因?yàn)榧?xì)菌的耐藥相關(guān)基因改變。這種耐藥發(fā)生的遺傳基礎(chǔ)大多是可移動(dòng)遺傳基因片段，如耐藥質(zhì)粒、插入序列、整合子和轉(zhuǎn)座子等水平傳播造成的。這些外源性的DNA片段常帶有耐藥基因，可以從一個(gè)細(xì)菌體轉(zhuǎn)移至另一個(gè)菌體，可以是同菌屬，也可以是異菌屬之間相互傳播，這種轉(zhuǎn)移可使耐藥菌不斷增多并易于傳遞播散。本組基因檢測(cè)結(jié)果顯示，46株鮑曼不動(dòng)桿菌β-內(nèi)酰胺酶的基因PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，TEM、OXA-2、ADC、CTX-M-1、CTX-M-2、IMP、OXA-24、ADC均為陽(yáng)性，且陽(yáng)性率均大于90%。結(jié)果提示：本組鮑曼不動(dòng)桿菌呈現(xiàn)多重耐藥可能與帶有這些可移動(dòng)遺傳基因片段有關(guān)，可移動(dòng)遺傳基因片段的陽(yáng)性存在使得鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)多種抗生素呈現(xiàn)多重重度耐藥，增加了臨床對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌所致的感染性疾病的治療難度，降低了臨床療效，帶給患者機(jī)體方面的傷害，甚至死亡。

從DNA的原位上單獨(dú)復(fù)制或斷裂形成的DNA順序片段，環(huán)化改變后插入另一位點(diǎn)，并對(duì)其后的基因起調(diào)控作用，這就是轉(zhuǎn)座過(guò)程。轉(zhuǎn)座子（transposons，Tn）是指一類(lèi)在細(xì)菌的染色體，質(zhì)?；蚴删w之間自行移動(dòng)的遺傳成分，能將自身基因插入基因組中任何一個(gè)在序列上與己無(wú)關(guān)的新位點(diǎn)的DNA序列。轉(zhuǎn)座子存在于染色體DNA，是可自主復(fù)制和移位的基本基因單位，可導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性的多樣化，并且易于傳遞散播。最簡(jiǎn)單的轉(zhuǎn)座子不帶有任何宿主基因而常被稱(chēng)為插入序列，它們是細(xì)菌染色體DNA或質(zhì)粒DNA的正常組成部分。插入序列（IS）是作為最簡(jiǎn)單的轉(zhuǎn)座元件，是細(xì)菌染色體和質(zhì)粒的正常組成成分，為一種可編碼轉(zhuǎn)座所需酶的轉(zhuǎn)座子。插入序列不僅移動(dòng)基因，并可導(dǎo)致被插入基因失活[17-18]。如：ISabl插入至鮑曼不動(dòng)桿菌碳青霉烯類(lèi)藥物特異性通道蛋白編碼基因中時(shí)，可導(dǎo)致該通道蛋白編碼基因失活而耐碳青霉烯類(lèi)藥物。轉(zhuǎn)座子不僅有傳播耐藥基因的功能，而且有使細(xì)菌已有耐藥基因高表達(dá)能力或破壞細(xì)菌本身結(jié)構(gòu)基因而使細(xì)菌耐藥。近年已有眾多文獻(xiàn)報(bào)道，處于ISabal、IS26、trip513下游的基因可出現(xiàn)高表達(dá)現(xiàn)象。近年國(guó)內(nèi)對(duì)耐藥菌的整合子研究報(bào)道較多，但對(duì)轉(zhuǎn)座子、插入序列的研究報(bào)道鮮見(jiàn)。本組插入序列遺傳標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果顯示，46株鮑曼不動(dòng)桿菌的插入序列遺傳標(biāo)記ISabal的檢出率為80.43%，IS26的檢出率為47.82%，tnp513的檢出率為52.17%。結(jié)果提示：插入序列的廣泛存在，使得鮑曼不動(dòng)桿菌的染色體DNA具有較強(qiáng)的自主復(fù)制和移位能力，可導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性的多樣化，也可以通過(guò)破壞原有的正?；蚨辊U曼不動(dòng)桿菌發(fā)生變異，以及通過(guò)提高細(xì)菌已有耐藥基因的表達(dá)能力，進(jìn)一步增加了鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)抗生素的耐藥性，從而導(dǎo)致鮑曼不動(dòng)桿菌出現(xiàn)易于傳遞散播的多重耐藥的特點(diǎn)。

β-內(nèi)酰胺酶基因廣泛存在于鮑曼不動(dòng)桿菌中，是鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)目前臨床常用的β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物存在多重耐藥的主要原因。多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥性與插入序列遺傳標(biāo)記有一定的相關(guān)性。為減少多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌株的數(shù)量，臨床上應(yīng)根據(jù)藥敏結(jié)果有針對(duì)性地選擇抗菌藥物，同時(shí)應(yīng)加強(qiáng)抗菌藥物的監(jiān)管，保護(hù)抗生素資源，做到合理用藥，減少盲目用藥，同時(shí)為了防止耐藥菌株的傳播應(yīng)加強(qiáng)消毒隔離管理制度，以達(dá)到提高治療疾病的水平的目的。

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（收稿日期：2014-03-18）