BioPlexTM 2200全自動(dòng)免疫分析儀檢測(cè)抗環(huán)瓜氨酸肽抗體的性能評(píng)估

趙 瀛， 黃 斐， 宋斌斌， 郭 瑋， 潘柏申

(上海復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬中山醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200032)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種系統(tǒng)性、慢性自身免疫性疾病。全球近1%的人群患有此病，且以老年人居多，女性發(fā)病率明顯高于男性，約為男性的3～4倍[1-2]。由于患者在發(fā)病2年內(nèi)即可出現(xiàn)不可逆的骨關(guān)節(jié)損傷，因此，RA的早期診斷和治療是防止關(guān)節(jié)進(jìn)一步損傷，提高患者生活質(zhì)量和生存率的關(guān)鍵[3-5]。

研究發(fā)現(xiàn)，抗環(huán)瓜氨酸肽(cyclic citrullinated peptide，CCP)抗體對(duì)于RA的早期診斷具有較高的靈敏度和特異性[6-8]，且抗體濃度與患者關(guān)節(jié)損傷的程度[9]以及藥物治療效果[10]相關(guān)，同時(shí)抗CCP抗體能較好地區(qū)分各類非RA疾病引起的關(guān)節(jié)痛和關(guān)節(jié)炎[11-12]。因此，2009年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)(ACR)和歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟(EULAR)將抗CCP抗體作為新的RA診斷標(biāo)準(zhǔn)之一[13]。

近年來(lái)，國(guó)外已開(kāi)展懸浮芯片技術(shù)檢測(cè)自身抗體[14-15]。2010年BioPlexTM2200全自動(dòng)免疫分析儀(簡(jiǎn)稱BioPlexTM2200)檢測(cè)抗CCP抗體通過(guò)了美國(guó)食品和藥物管理局(FDA)的認(rèn)證。該檢測(cè)系統(tǒng)的主要特點(diǎn)包括通量高、吸樣量少、特異性高、靈活性好[16]。目前，由于國(guó)內(nèi)運(yùn)用該技術(shù)檢測(cè)抗CCP抗體還處于起步階段。為了了解懸浮芯片技術(shù)及其配套試劑的分析性能和臨床實(shí)際應(yīng)用情況，我們對(duì)BioPlexTM2200檢測(cè)抗CCP抗體的檢測(cè)性能和初步臨床應(yīng)用進(jìn)行了評(píng)估。

材料和方法

一、研究對(duì)象

收集131例2012年12月至2013年1月期間至復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院風(fēng)濕科門診就診的患者和健康體檢者的血清樣本，-80℃保存至檢測(cè)。同時(shí)排除嚴(yán)重溶血、脂血和黃疸的樣本，根據(jù)臨床診斷將樣本分為RA組、非RA疾病對(duì)照組(簡(jiǎn)稱非RA組)和正常對(duì)照組。

1.RA組 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院風(fēng)濕科門診確診的RA患者65例，年齡26～89歲，診斷標(biāo)準(zhǔn)采用2009年ACR的RA診斷標(biāo)準(zhǔn)[13]。

2.非RA組 46例，年齡29～87歲。包括各類自身免疫性疾病31例(系統(tǒng)性紅斑狼瘡19例、血管炎5例、自身免疫性肝病2例、干燥綜合征4例、混合性結(jié)締組織病1例)和關(guān)節(jié)痛(炎)患者15例。

3.正常對(duì)照組 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院體檢中心表面健康體檢者20名，年齡46～87歲。

二、儀器和試劑

所有血清樣本同時(shí)在以下2個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)時(shí)各試劑盒均在有效期內(nèi)，且嚴(yán)格按照廠商規(guī)定的操作執(zhí)行。

1.BioPlexTM2200 Bio-Rad公司 BioPlexTM2200及配套抗 CCP抗體檢測(cè)試劑(批號(hào):109901)、校準(zhǔn)品(批號(hào):47297)和質(zhì)控品(批號(hào):47263)。檢測(cè)系統(tǒng)基本特征:檢測(cè)原理為流式點(diǎn)陣免疫發(fā)光法技術(shù)，Cut-off值為3.0 U/mL，線性范圍為0.5 ～300.0 U/mL。

2.Roche檢測(cè)系統(tǒng) Roche公司 Modular E170全自動(dòng)免疫分析儀及配套抗CCP抗體檢測(cè)試劑(批號(hào):170489)、校準(zhǔn)品(批號(hào):170489-01)和質(zhì)控品(批號(hào):170489-01)。檢測(cè)系統(tǒng)基本特征:原理為電化學(xué)發(fā)光法，Cut-off值為17.0 U/mL，線性范圍為7.0 ～500.0 U/mL。

三、方法

1.精密度評(píng)估 用BioPlexTM2200檢測(cè)高、中、低3種濃度樣本，每份樣本重復(fù)測(cè)定20次，連續(xù)測(cè)定20 d，計(jì)算批內(nèi)、天間的均數(shù)()、標(biāo)準(zhǔn)差(s)及變異系數(shù)(CV)，了解批內(nèi)、天間不精密度。

2.線性評(píng)估 取高值混合血清與低值混合血清按照4∶0、3∶1、2∶2、1∶3、0∶4 的比例進(jìn)行 5點(diǎn)稀釋(稀釋的5點(diǎn)基本覆蓋了線性范圍)，充分混勻，進(jìn)行復(fù)管檢測(cè)，并通過(guò)多項(xiàng)式回歸分析進(jìn)行線性評(píng)估，從而確認(rèn)最適方程，若最適方程為多項(xiàng)式，則通過(guò)計(jì)算最適方程與線性之間的平均線性偏倚(ADL)，與允許偏倚(5%)進(jìn)行比較，從而判斷是否呈線性[17]。

3.方法學(xué)比較 用BioPlexTM2200和Roche檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)血清抗CCP抗體水平，計(jì)算kappa值、總符合率、陽(yáng)性符合率以及陰性符合率進(jìn)行一致性分析。

4.臨床應(yīng)用評(píng)估 用BioPlexTM2200和Roche檢測(cè)系統(tǒng)分別檢測(cè)RA組、非RA組和正常對(duì)照組抗CCP抗體水平。同時(shí)采用受試者工作特征(ROC)曲線分析檢測(cè)結(jié)果，通過(guò)計(jì)算其曲線下面積(AUC)、最適Cut-off值、靈敏度、特異性、陽(yáng)性似然比、陰性似然比，評(píng)價(jià)RA的臨床診斷特性。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。使用SPSS軟件擬合二次、三次多項(xiàng)式回歸方程，并將非線性系數(shù)與“0”作t檢驗(yàn)得到P值，若P＜0.05即非線性系數(shù)與“0”的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，判斷為非線性，否則判斷為線性;ROC曲線分析得到2種檢測(cè)系統(tǒng)的AUC及最適Cut-off值，采用Z檢驗(yàn)比較AUC的差異;通過(guò)計(jì)算kappa值進(jìn)行一致性評(píng)價(jià)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、精密度評(píng)估

BioPlexTM2200批內(nèi)精密度和天間精密度均較好，能滿足臨床應(yīng)用需要。見(jiàn)表1。

表1 BioPlexTM 2200檢測(cè)系統(tǒng)精密度評(píng)估

二、線性評(píng)估

BioPlexTM2200線性驗(yàn)證的5個(gè)稀釋點(diǎn)濃度分別為0.5、67.8、134.6、209.2、294.6 U/mL，檢測(cè)線性范圍的多項(xiàng)式回歸分析結(jié)果見(jiàn)表2。最適多項(xiàng)式方程擬合值與線性擬合值的ADL＜5%，該檢測(cè)系統(tǒng)在臨床可接受范圍內(nèi)判斷為線性。

表2 BioPlexTM 2200檢測(cè)系統(tǒng)多項(xiàng)式回歸分析

三、方法學(xué)比較

2種檢測(cè)系統(tǒng)的檢測(cè)結(jié)果一致性分析見(jiàn)圖1和表3。

四、臨床運(yùn)用評(píng)估

2種檢測(cè)系統(tǒng)的ROC曲線和診斷特性參數(shù)見(jiàn)圖2和表4，兩者的AUC差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=0.42，P ＞0.05)。

表3 2種檢測(cè)系統(tǒng)一致性評(píng)估

圖1 2種檢測(cè)系統(tǒng)的Bland-Altman圖

圖2 2種檢測(cè)系統(tǒng)的ROC曲線分析

表4 2種檢測(cè)系統(tǒng)性能比較

討 論

抗CCP抗體作為RA診斷敏感且特異的指標(biāo)，在RA發(fā)病的早期即可出現(xiàn)，而且對(duì)于疾病的進(jìn)展和預(yù)后都有著重要的意義。為了滿足臨床運(yùn)用需求，抗CCP抗體檢測(cè)方法在靶抗原選擇上不斷改進(jìn)。2000年，Schellekens首次通過(guò)化學(xué)法固相合成含21位氨基酸的環(huán)瓜氨酸肽作為第1代檢測(cè)抗原，該方法檢測(cè)特異性約為98%，但靈敏度(41% ～68%)低于 RF[7，18-19]。2002 年，第 2 代檢測(cè)抗原開(kāi)始廣泛應(yīng)用于臨床。該抗原是通過(guò)篩選RA患者混合血清從而得到模擬真實(shí)構(gòu)象多肽[20]，較第 1代抗原檢測(cè)靈敏度明顯提高(64.4% ～96.0%)[21]。為了進(jìn)一步提高檢測(cè)性能，第3代檢測(cè)抗原也在不斷地研究中。與此同時(shí)，檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展也帶動(dòng)了檢測(cè)性能大幅度的改變。懸浮芯片技術(shù)作為新興的高通量檢測(cè)技術(shù)，其分析性能和臨床實(shí)際應(yīng)用價(jià)值都受到了廣泛關(guān)注。為了解該新技術(shù)及其相應(yīng)的檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)性能和臨床應(yīng)用價(jià)值，我們對(duì)BioPlexTM2200進(jìn)行評(píng)估，并與Roche檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行比較。

在精密度實(shí)驗(yàn)中，3種濃度的混合血清批內(nèi)和天間CV值均＜10%，符合定量試劑要求，能滿足臨床應(yīng)用需求。其中，中濃度血清接近醫(yī)學(xué)決定水平(Cut-off值=3.0 U/mL)，批內(nèi)和天間 CV均＜5%，表明Cut-off值對(duì)判斷是否存在抗CCP抗體有較高的穩(wěn)定性。BioPlexTM2200的精密度與Roche檢測(cè)系統(tǒng)相似[22]，且優(yōu)于傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)[24]。由于該檢測(cè)系統(tǒng)的整個(gè)反應(yīng)體系處于均相條件，有利于生物大分子保持其真實(shí)的空間構(gòu)象，從而保證檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性。

在線性評(píng)估實(shí)驗(yàn)中，BioPlexTM2200在臨床可接受范圍內(nèi)判定為線性，且驗(yàn)證的濃度范圍(0.5～294.6 U/mL)基本覆蓋了廠商推薦的檢測(cè)范圍(0.5 ～300 U/mL)。

本研究對(duì)BioPlexTM2200和Roche檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行了一致性分析。兩者具有較高的總體符合率，且kappa值＞0.85，顯示兩者檢測(cè)結(jié)果一致性較好。這可能與2種試劑盒均采用第2代人工合成的CCP作為檢測(cè)抗原有關(guān)，以此避免了包被不同的抗原肽所引起的差異。以上結(jié)果與Wyness等[22]的研究基本相符。然而，通過(guò)分析 Bland-Altman圖，發(fā)現(xiàn)少數(shù)超限標(biāo)本超出1.96s界限，這可能與目前臨床上使用的抗CCP抗體檢測(cè)系統(tǒng)沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)化，又缺乏國(guó)際參考物質(zhì)[23]有關(guān)。因此，不同醫(yī)療部門和檢測(cè)系統(tǒng)之間不可避免存在一定差異，這種現(xiàn)狀會(huì)給臨床應(yīng)用尤其是不同醫(yī)療部門之間的結(jié)果比對(duì)和資料分析帶來(lái)困擾。

在初步臨床應(yīng)用研究中，本研究對(duì)各組抗CCP抗體檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行ROC曲線分析。結(jié)果顯示Roche檢測(cè)系統(tǒng)的靈敏度和特異性略高于BioPlexTM2200。同時(shí)，為了解 BioPlexTM2200確診及排除RA的能力，本研究計(jì)算了其似然比。該檢測(cè)系統(tǒng)陽(yáng)性似然比＞10，對(duì)RA具有較明確的診斷價(jià)值。

本研究結(jié)果顯示131例研究對(duì)象中BioPlexTM2200和Roche檢測(cè)系統(tǒng)有8例抗CCP抗體結(jié)果不符。其中，7例臨床診斷為 RA，而 BioPlexTM2200檢測(cè)結(jié)果為陰性。Waterboer等[24]研究顯示，人類血清中可能存在能與BioPlexTM2200檢測(cè)試劑微珠直接結(jié)合的抗體。微珠與此類抗體結(jié)合會(huì)引起較強(qiáng)的非特異性背景，對(duì)結(jié)果可能產(chǎn)生一定的影響。1例臨床診斷為系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)，BioPlexTM2200檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)SLE患者血清中出現(xiàn)抗CCP抗體概率為7% ～20%[25-26]，且抗CCP抗體的出現(xiàn)可能與SLE關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度相關(guān)[25]。所以，對(duì)于RA的診斷，建議結(jié)合臨床表現(xiàn)、影像學(xué)資料以及其他血清學(xué)指標(biāo)進(jìn)行聯(lián)合判斷。

由于RA患者在發(fā)病的幾年內(nèi)即可出現(xiàn)不可逆的骨關(guān)節(jié)破壞，因此，臨床希望在發(fā)病早期即可對(duì)RA進(jìn)行診斷。本研究由于資源有限，僅對(duì)病程＞2年且已確診的RA患者進(jìn)行研究，未能對(duì)早期RA患者(首次癥狀出現(xiàn)＜1年)進(jìn)行隨訪，無(wú)法進(jìn)一步評(píng)估BioPlexTM2200對(duì)早期RA的診斷價(jià)值。同時(shí)，本研究未能獲取RA患者影像學(xué)資料，評(píng)價(jià)抗CCP抗體的滴度與RA患者關(guān)節(jié)浸潤(rùn)程度之間的關(guān)系。因此，在早期診斷RA以及預(yù)測(cè)骨關(guān)節(jié)損傷方面，BioPlexTM2200還尚待更進(jìn)一步研究闡明。

總體而言，BioPlexTM2200分析性能較好，對(duì)于RA的診斷具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。然而，抗CCP抗體檢測(cè)試劑的未標(biāo)準(zhǔn)化會(huì)導(dǎo)致不同的檢測(cè)系統(tǒng)結(jié)果之間存在差異，所以標(biāo)準(zhǔn)化是今后需要攻克的難題。

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