LFA-1基因缺失對小鼠Na?ve T細胞體外向Th17細胞分化的影響*

孫 淼 于成功

南京醫(yī)科大學(xué)鼓樓臨床醫(yī)學(xué)院消化科1(210008) 南京醫(yī)科大學(xué)附屬鼓樓醫(yī)院消化科2

大量實驗研究表明Th17細胞是連接固有免疫與獲得性免疫的橋梁，除清除入侵的病原微生物外，尚與自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[1]。Th17細胞分泌的細胞因子白細胞介素-17A(IL-17A)、IL-6等可促進T細胞活化，刺激上皮細胞、成纖維細胞分泌多種細胞因子如趨化因子受體CCR6、IL-8以及細胞黏附分子-1(CAM-1)等，對中性粒細胞起動員、活化作用，進而誘導(dǎo)或加重炎癥反應(yīng)。隨著對T細胞研究的不斷深入，T細胞受體(TCR)及其共受體/配體系統(tǒng)與T細胞活化和功能的關(guān)系在作為自身免疫性疾病之一的炎癥性腸病(IBD)中的意義引起關(guān)注。淋巴細胞功能相關(guān)抗原-1(lymphocyte function-associated antigen-1, LFA-1)是淋巴細胞活化的重要共刺激受體，參與T細胞的活化和功能調(diào)節(jié)，能增強抗原呈遞細胞活性，維持抗炎與促炎因子平衡。LFA-1在調(diào)節(jié)性T細胞(Treg細胞)的穩(wěn)態(tài)和功能發(fā)揮中的作用已得到認可[2]，與Th17細胞分化和功能的關(guān)系則尚無定論。本實驗旨在觀察不同誘導(dǎo)條件下LFA-1基因缺失(LFA-1-/-)對小鼠脾臟初始T細胞(Na?ve T細胞)體外向Th17細胞分化的影響，探討LFA-1參與IBD的潛在機制。

材料與方法

一、實驗動物和主要試劑、儀器

LFA-1-/-小鼠15只，為購自Jackson Laboratory的純合子LFA-1-/-小鼠(Strain Name: B6.129S7-Itgaltm1Bll/J, Stock Number: 005257)在南京鼓樓醫(yī)院動物實驗中心SPF條件下繁殖的子代小鼠，均經(jīng)基因型鑒定篩選。具有相同遺傳背景的LFA-1+/+[野生型(WT)]C57BL/6J小鼠15只作為對照組。兩組小鼠均為6～10周齡，雌鼠7只，雄鼠8只。

RPMI 1640培養(yǎng)基、FBS(Gibco?, Thermo Fisher Scientific Inc.)，ReadyMixTMTaq PCR反應(yīng)混合物(Sigma-Aldrich Co. LLC.)，淋巴細胞分離液(深圳市達科為生物技術(shù)有限公司)，CD4+CD62L+Na?ve T細胞磁珠分選試劑盒、Mini & MidiMACSTM分選器、分選緩沖液(Miltenyi Biotec)，CD4-FITC、CD62L-PE、IL-17A-PE熒光標記單克隆抗體和CD3、CD28單克隆抗體(eBioscience, Inc.)，重組人轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)、重組小鼠IL-6和IL-23、小鼠IL-17A ELISA試劑盒(R&D Systems, Inc.)，RNAiso Plus試劑、PrimeScriptTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Perfect Real Time)、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)(Takara Bio Inc.)。

BD FACSCantoTM流式細胞儀(BD Biosciences)，普通PCR儀、7500 Fast Real-Time PCR儀(Applied Biosystems?, Thermo Fisher Scientific Inc.)。

二、方法

1. PCR鑒定篩選LFA-1-/-子代小鼠：從Jackson Laboratory基因庫中得到LFA-1 PCR引物序列：olMR0204: CAC GGG TAG CCA ACG CTA TGT C, olMR0221: GCC CTG AAT GAA CTG CAG G, olMR3637: AGA AGC CAC CAT TTC CCT CT, olMR3638: AGC TGG AGT CCC AGT AGC AA，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。隨機選取15只子代小鼠，剪除3 mm鼠尾尖端，編號并作標記，加入裂解緩沖液A(1 g NaOH + 0.372 g EDTA，溶于0.8 L去離子水中，定容至1 L)100 μL，95 ℃ 20 min(DNA快速提取法)，冷卻后加入裂解緩沖液B(6.3 g Tris-HCl溶于0.8 L去離子水中，定容至1 L)100 μL和ReadyMixTMTaq PCR反應(yīng)混合物，行PCR擴增。擴增產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)掃描并分析結(jié)果。

2. 磁珠分選小鼠脾臟CD4+CD62L+Na?ve T細胞：每次于無菌屏障內(nèi)取2只同組小鼠脾臟，細胞篩研磨，與5～8 mL淋巴細胞分離液充分混合，緩慢加入1 mL含15% FBS的完全培養(yǎng)基，300×g梯度離心30 min，分離得到單個核細胞懸液，計數(shù)后取1×108個細胞用于分選。細胞以分選緩沖液重懸至400 μL，按磁珠分選試劑盒說明書要求進行CD4+CD62L+Na?ve T細胞分選，分選得到的細胞離心后重懸于含15% FBS的完全培養(yǎng)基，密度調(diào)整至1×106/mL。

3. 流式細胞術(shù)檢測Na?ve T細胞純度：分別取5×105個分選得到的細胞至2個流式管，300×g離心 5 min，吸去上清，以流式緩沖液重懸至100 μL，其中一管不加熒光標記抗體(空白對照)，另一管加入CD4-FITC、CD62L-PE單抗各1 μL，4 ℃避光孵育40 min，流式緩沖液清洗2次后重懸至500 μL，上流式細胞儀檢測。

4. Na?ve T細胞體外誘導(dǎo)Th17細胞：磁珠分選細胞前夜以無菌PBS包被96孔板，每孔50 μL，包被液中分別加入CD3單抗10 μg/mL和CD28單抗5 μg/mL，4 ℃孵育過夜。將LFA-1-/-組和WT對照組分選得到的細胞密度調(diào)整至1×106/mL，分別進一步分為四組，予不同細胞因子誘導(dǎo)：空白對照組(不添加任何細胞因子)，TGF-β組(重組人TGF-β 3 ng/mL)，TGF-β+IL-6組(重組人TGF-β 3 ng/mL，重組小鼠IL-6 40 ng/mL)，TGF-β+IL-6+IL-23組(重組人TGF-β 3 ng/mL，重組小鼠IL-6 40 ng/mL，重組小鼠IL-23 30 ng/mL)。取出冰箱內(nèi)包被好的96孔板，PBS清洗1次，將各組細胞懸液以每孔200 μL加入96孔板，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72～96 h，行Th17細胞比率檢測。

5. 流式細胞術(shù)檢測Th17細胞比率：每個待測細胞培養(yǎng)孔加入細胞因子刺激劑PMA 200 ng/mL、IONO 500 ng/mL，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱孵育1 h，再加入細胞因子釋放阻斷劑BFA 300 μg/mL，繼續(xù)孵育4～5 h，收集待測細胞至流式管(每管5×105個細胞)，300×g離心5 min，吸去上清，以流式緩沖液重懸至100 μL, 加入CD4-FITC 1 μL，4 ℃避光孵育40 min，清洗1次后加入500 μL破膜固定劑，4 ℃避光孵育30 min，重懸至100 μL，分別加入IL-17A-PE單抗和IgG-PE(陰性對照)各1 μL，4 ℃避光孵育30 min，流式緩沖液清洗1次，以10×固定液重懸至300 μL，上流式細胞儀檢測。

6. 熒光定量PCR：收集經(jīng)TGF-β+IL-6+IL-23誘導(dǎo)的細胞，RNAiso Plus試劑裂解提取RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行操作合成cDNA。引物序列：目的基因ROR-γt F 5’-CAC GGC CCT GGT TCT CAT-3’，R 5’-GCA GAT GTT CCA CTC TCC TCT TCT-3’；目的基因IL-17A F 5’-AGC TTT CCC TCC GCA TTG A-3’，R 5’-GCT CCA GAA GGC CCT CAG A-3’；內(nèi)參照GAPDH F 5’-CAT GGC CTT CCG TGT TCC TA-3’，R 5’-TGT CAT CAT ACT TGG CAG GTT TCT-3’。按熒光定量PCR試劑盒說明書進行操作，2-ΔΔCt法計算目的基因mRNA相對表達量。

7. ELISA法檢測IL-17A濃度：收集經(jīng)TGF-β+IL-6+IL-23誘導(dǎo)的細胞培養(yǎng)上清液，按試劑盒說明書進行操作，檢測IL-17A濃度。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、子代小鼠基因型鑒定

PCR鑒定篩選顯示隨機選取的15只子代小鼠(分別標記為A1～6、C1～5、D1～3和D5，D4為加樣失誤，不作為統(tǒng)計樣本)均為LFA-1-/-小鼠(圖1)。

P：陽性對照(親代純合子LFA-1-/-小鼠基因組DNA)；B6：陰性對照(WT對照組小鼠基因組DNA)；N：空白對照

二、磁珠分選小鼠脾臟Na?ve T細胞純度

流式細胞分析顯示，分選前CD4+T細胞純度為12.2%(圖2A)，分選后得到的CD4+T細胞純度均大于96%(圖2B)；以分選后單獨標記CD4作為空白對照(圖2C)，對比確定分選后CD4+CD62L+Na?ve T細胞純度大于95%(圖2D)。表明所采用的磁珠分選方法能成功分選出高純度的Na?ve T細胞，為后續(xù)實驗的順利進行提供了保證。

三、Na?ve T細胞體外誘導(dǎo)Th17細胞

組內(nèi)比較：WT對照組Na?ve T細胞經(jīng)低劑量TGF-β刺激后，Th17細胞比率為0.5%±0.3%，與空白對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；TGF-β+IL-6聯(lián)合刺激能誘導(dǎo)出少量Th17細胞，比率為1.5%±0.1%，與空白對照組和TGF-β組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義；在TGF-β聯(lián)合IL-6刺激的基礎(chǔ)上加入IL-23，Th17細胞比率升高至5.7%±0.2%，與空白對照組、TGF-β組和TGF-β+IL-6組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(圖3A、3C)。LFA-1-/-組Na?ve T細胞經(jīng)低劑量TGF-β刺激后，Th17細胞比率已達4.4%±0.4%；IL-6的加入使該比率升高至14.1%±1.0%；在此基礎(chǔ)上加入IL-23，Th17細胞比率進一步升高至17.2%±1.4%，組內(nèi)兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(圖3B、3D)。

A：分選前CD4+ T細胞比率；B：分選后CD4+ T細胞比率；C：分選后CD4+CD62L- T細胞比率；D：分選后CD4+CD62L+ T細胞比率

*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

組間比較：在相同誘導(dǎo)分化體系中(TGF-β+IL-6+IL-23)，LFA-1-/-組Na?ve T細胞誘導(dǎo)出的Th17細胞比率明顯高于WT對照組，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖3E)。

四、ROR-γt和IL-17A mRNA表達

熒光定量PCR檢測顯示，LFA-1-/-組Na?ve T細胞經(jīng)TGF-β+IL-6+IL-23誘導(dǎo)后，ROR-γt和IL-17A mRNA相對表達量分別為4.002±0.076和5.161±0.168，分別明顯高于WT對照組的1.214±0.109 和 1.038±0.035，相應(yīng)組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。

五、細胞培養(yǎng)上清液IL-17A濃度

ELISA檢測顯示，LFA-1-/-組Na?ve T細胞經(jīng)TGF-β+IL-6+IL-23誘導(dǎo)后，細胞培養(yǎng)上清液中IL-17A濃度為(1 049.70±48.86) pg/mL，明顯高于WT對照組的(634.64±51.72) pg/mL，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

討 論

從胸腺遷移至外周的Na?ve T細胞經(jīng)特定細胞因子刺激活化后，產(chǎn)生特定的效應(yīng)表型，包括Th1、Th2、Th17細胞，在對抗大量病原體、組織損傷和其他免疫缺陷時發(fā)揮不同生物學(xué)功能[3]，對Th17途徑的研究發(fā)現(xiàn)其分化具有可塑性[4]。Th17細胞分泌的效應(yīng)細胞因子主要有IL-17A、IL-17F、IL-21、IL-22等，其中以IL-17A促炎能力最強，被認為是Th17細胞的特異性標記物[5]，而ROR-γt為其特異性轉(zhuǎn)錄因子[3]。Th17細胞及其效應(yīng)細胞因子除介導(dǎo)宿主對外來細菌感染的防御機制外，還參與了多種自身免疫性疾病的發(fā)生，其在自身免疫性疾病中的作用包括上調(diào)促炎細胞因子、趨化因子表達，引起組織炎性細胞浸潤和組織破壞，加速細胞凋亡[6]，被認為是IBD炎癥反應(yīng)的始動因素。

淋巴細胞在免疫監(jiān)視和免疫反應(yīng)中，其遷移、滲出、活化均與其黏附能力密切相關(guān)，LFA-1與細胞間黏附分子-1(ICAM-1)介導(dǎo)的跨膜雙向信號傳遞在其中起重要作用；此外，LFA-1與ICAM-1亦是與淋巴細胞活化密切相關(guān)的共刺激受體/配體[7]。LFA-1為黏附分子β2 整合素家族成員，是由α鏈(CD11a)與β鏈(CD18)兩個亞單位通過非共價鍵連接形成的異二聚體(αLβ2)，表達于大部分淋巴細胞表面，為其活化提供第二信號，并具有降低TCR閾值的作用[8-10]。近年來，一些研究探討了LFA-1基因缺失動物模型對炎癥刺激的反應(yīng)，但結(jié)論爭議頗多。Wang等[11]對小鼠實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)模型的研究發(fā)現(xiàn)，敲除LFA-1基因能抑制引流淋巴結(jié)內(nèi)的淋巴細胞募集和抗原特異性Th17細胞產(chǎn)生，降低EAE發(fā)生率，減輕EAE炎癥程度。Haasken等[12]則發(fā)現(xiàn)敲除β2整合素基因可使小鼠Treg細胞功能受損，免疫應(yīng)答異常激活，從而加重自身免疫性心內(nèi)膜炎。因此，LFA-1似具有抗炎與促炎的雙向作用。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)潰瘍性結(jié)腸炎(UC)和克羅恩病(CD)患者外周血單個核細胞LFA-1表達顯著低于健康對照者[13]，推測外周血LFA-1高表達的淋巴細胞群遷移至腸黏膜可能是引起IBD腸黏膜炎癥的重要因素；同時發(fā)現(xiàn)IBD患者外周血中Treg細胞比率顯著降低，Th17細胞比率顯著升高，并與疾病活動度相關(guān)[14-15]。隨后進行的動物實驗發(fā)現(xiàn)，LFA-1-/-小鼠外周血中CD4+細胞、Treg細胞比率明顯低于野生型小鼠，對葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎癥的耐受性較野生型小鼠差；LFA-1-/-結(jié)腸炎小鼠血清TGF-β1、IL-10、IL-17A水平明顯高于未誘導(dǎo)結(jié)腸炎的LFA-1-/-小鼠，但低于野生型結(jié)腸炎小鼠[16]，再次表明LFA-1與IBD發(fā)病密切相關(guān)，并可能對T細胞的誘導(dǎo)分化和Treg/Th17比例產(chǎn)生影響。

為驗證上述假設(shè)，本實驗進一步觀察了LFA-1基因缺失對小鼠脾臟Na?ve T細胞體外向Th17細胞分化的影響。實驗結(jié)果顯示，對于野生型小鼠的Na?ve T細胞，TGF-β單獨存在不能有效誘導(dǎo)其向Th17細胞分化，而TGF-β與IL-6共同作用可提高Th17細胞比率(1.5%±0.1%)；誘導(dǎo)分化體系中再加入IL-23，Th17細胞比率進一步升高(5.7%±0.2%)，表明IL-23可激活Th17細胞并維持其穩(wěn)定性[1]。然而，對于LFA-1-/-小鼠的Na?ve T細胞，低劑量TGF-β即可產(chǎn)生較高的Th17細胞誘導(dǎo)率(4.4%±0.4%)，而TGF-β與IL-6共同作用可使誘導(dǎo)效應(yīng)明顯增強(14.1%±1.0%)；誘導(dǎo)分化體系中再加入IL-23，Th17細胞比率可進一步升高至17.2%±1.4%。在相同誘導(dǎo)分化體系中(TGF-β+IL-6+IL-23)，LFA-1-/-小鼠的Na?ve T細胞體外向Th17細胞分化的能力顯著強于野生型小鼠的Na?ve T細胞，隨后進行的基因水平和細胞因子水平的檢測亦顯示該組Th17細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子ROR-γt、特異性標記物IL-17A mRNA表達和細胞培養(yǎng)上清液中的IL-17A濃度均顯著高于野生型小鼠。上述結(jié)果表明，在相同誘導(dǎo)分化體系中，LFA-1-/-與LFA-1+/+相比更有利于Th17細胞的誘導(dǎo)分化，即LFA-1基因缺失對小鼠脾臟Na?ve T細胞體外向Th17細胞分化具有明顯促進作用。

綜上所述，本研究成功確立了小鼠脾臟Na?ve T細胞體外向Th17細胞分化的誘導(dǎo)分化體系，并發(fā)現(xiàn)LFA-1基因缺失能促進Na?ve T細胞向Th17細胞分化，為后續(xù)Th17途徑及其致炎作用的研究奠定了實驗基礎(chǔ)。如能深入研究LFA-1對Th17細胞功能的影響，有可能為IBD的治療提供新的思路和藥物靶點。

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