RP-HPLC法測定人血清中萬古霉素的濃度

福建醫(yī)科大學附屬漳州市醫(yī)院藥學部，福建 漳州 363000

RP-HPLC法測定人血清中萬古霉素的濃度

陳宜鋒李碧峰*黃小紅馮惠平

福建醫(yī)科大學附屬漳州市醫(yī)院藥學部，福建 漳州 363000

目的建立血清中萬古霉素濃度的反相高效液相色譜法的測定方法。方法以去甲萬古霉素為內標，血清樣品經10%高氯酸溶液沉淀，采用TC-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以甲醇-0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀(18∶82)為流動相，流速為1.0 ml·min-1，紫外檢測波長為230 nm。結果在1.0～100.0 mg·L-1濃度范圍內線性良好(r=0.999 89，n=7)，回收率高，日內、日間RSD均小于3%，理論塔板數大于6 000，最低檢測限為0.12 mg·L-1。結論本法樣品取樣量少，處理方法簡便，靈敏度高，方法準確穩(wěn)定，回收率高，適用于臨床常規(guī)血藥濃度監(jiān)測及相關科研的應用。

萬古霉素；去甲萬古霉素；血藥濃度；高效液相色譜法

萬古霉素(vancomycin，VAN)臨床主要用于治療革蘭陽性菌嚴重感染，也用于血液透析患者發(fā)生葡萄球菌屬所致的動靜脈分流感染，口服適用于甲硝唑無效的假膜性結腸炎或多重耐藥葡萄球菌小腸結腸炎[1]。但高濃度的萬古霉素可導致可逆性耳聾、耳鳴、聽力損害及腎損害等不良反應，毒性較大，且萬古霉素的耐藥菌感染成為臨床上非常棘手的問題，因此在臨床應用過程中特別是存在腎功能損害或合并使用有腎功能損害的藥物時，需要監(jiān)測人體內的血藥濃度。本實驗摸索了高效液相色譜法測定人血清中萬古霉素的濃度，可供臨床日常監(jiān)測使用。

1 儀器與試劑

Aglient HPLC 1100型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；ChemStation A.10.OX化學工作站；WH-861旋渦混合器(太倉市科教器材廠)；TP-300型超聲波清洗機(北京天鵬電子新技術有限公司)；SIGMA-3K15離心機(德國Sigma公司)；AE-240型電子分析天平(梅特勒托利多有限公司)；185個人型超純水機(美國Millipore公司)；AE-320型pH計(梅特勒托利多有限公司)。

萬古霉素、去甲萬古霉素標準品均購自中國藥品生物制品檢定所；甲醇(色譜純，美國Tedia公司)；超純水(本實驗室制備，即蒸餾水經Millipore純水機去離子水)；血清(門診健康體檢者，由我院檢驗科提供)；其余試劑均為國產分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱為Agilent TC-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為磷酸二氫鉀緩沖液(0.05 mol·ml-1，pH=3.2)-甲醇(82∶18)(V/V)；流速為1.0 ml·min-1；檢測波長為230 nm；柱溫為33℃；進樣量為20 μl。

2.2 溶液的配制 標準品的配制：精確稱取萬古霉素標準品50 mg于50 ml量瓶中，加水溶解至刻度，配成濃度為1 g/L的儲備液；臨用時精密量取萬古霉素儲備液1 g/L適量分別稀釋成10.0、50.0、100.0、200.0、400.0、800.0、100 0.0 mg/L的溶液，置冰箱待用。

內標液的配制：精密稱取去甲萬古霉素標準品15 mg于25 ml量瓶中，加水溶解至刻度，配成濃度為0.6 g/L的溶液置冰箱待用。

2.3 血清樣品的處理 往空白血清中加入內標液20 μl，再加入10%高氯酸溶液40 μl，漩渦充分混勻3 min，10 000 rpm，4℃離心10 min，取上清液130 μl，加入1 mol/L氫氧化鈉溶液10 μl，漩渦充分混勻30 s后，取上清液20 μl進樣。

2.4 色譜分離情況 空白血清、血清中加標準品、血清中加內標物、血清中加標準品和內標物，分別按上述樣品處理方法進行處理，結果見下圖1。由圖可見，在上述實驗條件下，血清內源性雜質對萬古霉素、去甲萬古霉素均無干擾，且萬古霉素與內標去甲萬古霉素能有效分離。

2.5 標準曲線的制備 取7根具塞試管中分別加入160 μl空白血清，每根試管中加入20 μl內標液，然后精密量取上述標準品溶液20 μl，依照順序加入試管中，按上述色譜條件處理樣品。以萬古霉素的濃度X(C，mg·L-1)為橫坐標，測得的萬古霉素峰面積AV與內標液峰面積AN之比Y為縱坐標進行線性回歸，得標準曲線方程為Y=0.016 014 22X-0.005 080 7(r=0.999 89，n=7)。表明萬古霉素的血藥濃度在1.0～100.0 mg·L-1范圍內呈良好的線性關系，理論塔板數大于6 000。以大于基線3倍信噪比(S/N)為最低檢測限，得出萬古霉素濃度最低檢測限為0.12 mg·L-1。

2.6 回收率試驗 分別精密吸取標準液適量，加入160μl空白血清中，配成濃度分別為10.0、40.0、80.0 mg·L-1的溶液各5份，按上述色譜條件處理，以標準曲線計算出萬古霉素的血藥濃度，以測得值與加入值之比計算回收率。結果低、中、高濃度的方法回收率分別為100.3%、99.8%、100.2%，平均回收率為100.1%。

表1 日內精密度和日間精密度

2.7 精密度的測定 取低、中、高三種濃度的標準液，分別配成濃度為10.0、40.0、80.0 mg·L-1的溶液各5份，按上述色譜條件處理，以標準曲線計算出萬古霉素的血藥濃度，每種濃度1天內測定5次，測得的萬古霉素濃度計算日內精密度；同法操作以1周內3個樣品每種濃度連續(xù)5天測得的萬古霉素濃度計算日間精密度。結果低、中、高3種濃度的日內RSD分別為1.60%、0.71%和0.65%，日間RSD分別為2.92%、1.19%和0.62%，均小于3%。記錄如表1。

2.8 穩(wěn)定性試驗 取萬古霉素對照品溶液(40mg·L-1)20 μl按“2.6”項下操作，分別在0、6、12、24、48、72 h(除0 h外均行冷凍后再融處理)進樣測定，記錄峰面積。結果，峰面積的RSD=1.46%，表明對照品溶液在72 h內基本穩(wěn)定。

2.9 樣品測定 取臨床血清樣品5份，按“2.3”項下操作，測定萬古霉素血藥濃度分別為8.12、12.23、18.44、24.71、16.80 mg·L-1。萬古霉素及內標物出峰時間快、患者血清內源性雜質影響較小，為臨床及時提供了調整給藥方案的依據。

3 討論

3.1 血清濃度與血漿濃度 有報道[2-4]考慮到只有游離型藥物才能運到作用部位產生藥理效應，通常也僅是其與藥理作用強度密切相關，大部分存在于血清中；結合型藥物相對分子質量增大，不能跨膜轉運、代謝或排泄，暫時失去藥理作用而儲存在血液中。因此，筆者采用了測定藥物的血清濃度。

3.2 內標物的選擇 關于內標物的選擇，一般選擇結構相近的物質。有報道[5]采用維生素B12作為內標，梯度洗脫后使維生素B12出峰提前，但其程序復雜，因此未用維生素B12作為內標液；還有文獻[4]指出用替硝唑作為內標，但是不能排除臨床應用過程中由于患者同時感染厭氧菌而合并使用替硝唑而影響內標物定量的情況。而去甲萬古霉素不僅結構與萬古霉素相近，其作用機制、抗菌譜、排泄途徑及適應癥也均與萬古霉素相似，且兩者不會同時使用，因此采用去甲萬古霉素作為內標物。

3.3 蛋白沉淀劑的選擇 目前報道使用的蛋白沉淀劑有甲醇[4]、乙腈-異丙醇[3]、乙腈-二氯甲烷[6]、固相萃取[7]、三氯醋酸[8]或硫酸鋅[2]等。由于萬古霉素不溶于甲醇、乙腈等有機溶劑，固相萃取成本太高，三氯醋酸不穩(wěn)定需現用現配等原因，筆者初篩選出硫酸鋅和高氯酸作為蛋白沉淀劑來對比試驗研究。試驗中發(fā)現用20%硫酸鋅沉淀血清高速離心(10 000 rpm)后取出上清液不久，又再次出現渾濁現象，增加離心轉速(14 000 rpm)及延長離心時間(20 min)后發(fā)現上述現象仍然如此。經過反復驗證，使用硫酸鋅沉淀都不能獲得滿意效果。筆者認為可能由于硫酸鋅沉淀蛋白是可逆性的，取出上清液時硫酸鋅的濃度發(fā)生了變化，離心后放置一段時間，硫酸鋅復溶導致溶液渾濁影響進樣。而高氯酸沉淀蛋白的過程是不可逆過程，可以使血清蛋白沉淀完全。但考慮到高氯酸是強酸，對色譜柱壽命有影響，所以最后加入1 mol·L-1氫氧化鈉溶液10 μl中和酸性以保護色譜柱。

此外，pH值對研究影響較大，過酸保留時間延長，過堿保留時間縮短，且均會使峰面積降低，因此正確調節(jié)pH值至關重要。通過試驗摸索最終確定33℃甲醇:磷酸二氫鉀(18:82，pH=3.2)時萬古霉素、去甲萬古霉素的保留時間較合適且血清等內源性雜質無干擾，峰形較好，基線穩(wěn)定，準確度及靈敏度高，重現性好。該方法樣品取樣量少，處理方法簡便，適用于臨床常規(guī)血藥濃度監(jiān)測及相關科研的應用。

[1]衛(wèi)生部合理用藥專家委員會組織編寫.中國醫(yī)師藥師臨床用藥指南2010年版[M].重慶：重慶出版社，2009：157.

[2]蔣碩民，戚雙雙，王增壽.高效液相色譜法測定人血漿中萬古霉素濃度[J].中國醫(yī)院藥學雜志，2006，26(11)：1364-1366.

[3]林玉仙，蘇煌財.高效液相色譜法測定萬古霉素的血藥濃度[J].中國醫(yī)院藥學雜志，2009，29(8)：637-639.

[4]范捷，郭志磊，于洋，等.高效液相色譜法測定萬古霉素血藥濃度[J].中國醫(yī)院藥學雜志，2012，32(12)：1590-1592.

[5]Diana J，Visky D，Rotts E，etal.Development and validation of an improved method for the analysis of vancomycin by liquid chromatography selectivity of reversed-phase colums towards vancomycin components [J].J Chromatogr A，2003，996(1- 2)：115-131.

[6]張文娟，宋新文，汪洋，等.固態(tài)萃取高效液相色譜法測定萬古霉素血藥濃度[J].中國臨床藥理學雜志，2011，27(2)：149-151.

[7]林秀麗，朱金平，費燕.HPLC法快速測定萬古霉素和去甲萬古霉素的血藥濃度[J].中國臨床藥學雜志，2011，20(4)：231-233.

[8]杜貫濤，謝小菊，劉廣軍，等.高效液相色譜法測定人血漿中萬古霉素質量濃度[J].中國藥業(yè)，2009，18(13)：17-18.

DeterminationofVancomycininHumanSerumbyRP-HPLC

CHEN Yi-feng,LI Bi-feng,HUANG Xiao-hong,FENG Hui-ping

Department of Pharmacy,，Zhangzhou Municipal Hospital Affiliated to Fujian Medical University，Zhangzhou 363000，China

ObjectiveTo develop a method for the determination of vancomycin concentration in human serum by high-performance liquid chromatography(HPLC).MethodNorvancomycin was used as internal standard and the sample deposited by 10% perchloric acid was separated on TC-C18 analysis column(250 mm×4.6 mm, 5 μm) with a mobile phase of mixture of methanol:0.05mol·L-1potassium dihydrogen phosphate(18∶82). The flow rate was 1ml/min, the UV detector wavelength was set up 230 nm.ResultThe calibrated linear plot of vancomycin was within 1.0～100.0 mg/L(r=0.999 89,n=7), the average recoveries in serum were high, intra-day RSD and inter-day RSD were both less than 3%, the theoretical plate number were more than 6 000,the limit of test was 0.12 mg·L-1.ConclusionThe method is accurate, simple, sensitive and suitable for the study of therapeutic drug monitoring for vancomycin in human serum in clinic and other fields.

vancomycin;norvancomycin; serum drug concentration;HPLC

陳宜鋒,主管藥師，主要從事臨床藥學研究。E-mail： brantchan@hotmail.com

李碧峰,副主任藥師，主要從事醫(yī)院藥學研究。E-mail：lbf.307@163.com

R284.1

A

1007-8517(2014)11-0011-03

2014.04.07)