馬錢子堿通過(guò)阻滯細(xì)胞周期抑制人肺癌細(xì)胞株P(guān)C-9增殖

李苗 李平 張梅 馬峰 蘇麗

肺癌是影響我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，且發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢(shì)[1]，盡管目前治療肺癌的方法較多，尤其目前靶向治療對(duì)于表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）突變型肺癌有很好療效，但是由于患者對(duì)各種治療表現(xiàn)出的耐藥性及部分EGFR突變患者無(wú)法接受價(jià)格昂貴的靶向制劑導(dǎo)致治療失敗，5年生存率仍然較低[2]，其至今仍為人類最難治療的惡性腫瘤之一[3]，因此尋求新的藥物治療肺癌從而改善患者預(yù)后顯得尤為迫切[4]。

祖國(guó)醫(yī)學(xué)博大精深，馬錢子為馬錢科植物馬錢或皮氏馬錢的成熟種子，為辛溫大毒之品，廣泛應(yīng)用于各種腫瘤的臨床治療。其主要有效成份為士的寧（Strychnine）、馬錢子堿（Brucine）等吲哚型生物堿[5]。近年來(lái)諸多研究[6-16]提出中藥單體馬錢子堿無(wú)論是體內(nèi)試驗(yàn)還是體外實(shí)驗(yàn)，都表現(xiàn)出對(duì)多種腫瘤細(xì)胞有明顯的抗腫瘤作用，并且涉及到多種抗腫瘤作用機(jī)制，但是有關(guān)馬錢子堿對(duì)于EGFR突變型肺癌細(xì)胞PC-9的作用及其可能的機(jī)制，目前均未見(jiàn)報(bào)道。因此本研究以EGFR突變型肺癌細(xì)胞PC-9為研究對(duì)象，觀察馬錢子堿對(duì)PC-9細(xì)胞的體外作用。

1 材料與方法

1.1 材料 Brucine購(gòu)自美國(guó)Sigma，用DMSO溶解Brucine配成150 mM，-20oC貯存?zhèn)溆茫ū芄猓Ｈ朔伟┘?xì)胞株P(guān)C-9由北京生命科學(xué)研究所陳良實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。RPMI-1640培養(yǎng)液和小牛血清購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；CellTiter-Glo購(gòu)自美國(guó)Promega公司；Trizol總RNA提取試劑購(gòu)自Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒購(gòu)自大連寶生物（TaKaRa）公司；RT2 SYBR? Green qPCR Mastermix購(gòu)自美國(guó)SABiosciences公司；Rabbit anti-Cyclin D1、Rabbit anti-Cyclin E購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；二抗購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 CellTiter-Glo發(fā)光法（The CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay）檢測(cè)細(xì)胞活力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，輕輕吹打制成5×104/mL的單細(xì)胞懸液，每孔100 μL接種于96孔板中，細(xì)胞貼壁后棄上清。各組分別加入100 μL含Brucine 800 μM、400 μM、200 μM、100 μM、0 μM的1640培養(yǎng)液，每組5個(gè)平行孔，同時(shí)設(shè)不含藥物的正常對(duì)照孔（對(duì)照），等體積的DMSO溶劑對(duì)照孔（DMSO）和空白對(duì)照孔。分別繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h、72 h。實(shí)驗(yàn)結(jié)束前，每孔加入100 μL CellTiter-Glo（提前24 h 4oC解凍），于振蕩儀上震蕩10 min，用酶標(biāo)儀在Luminescent模式下檢測(cè)各孔的吸光度（A），用空白對(duì)照組調(diào)零，據(jù)各孔的吸光度計(jì)算各組細(xì)胞的增殖抑制率。應(yīng)用直線回歸法計(jì)算半數(shù)抑制濃度（concentration of 50% inhibition,IC50）值。

增殖抑制率（inhibitory rate, IR/%）= （對(duì)照組A-實(shí)驗(yàn)組A）/對(duì)照組A×100%。

1.2.2 細(xì)胞平板克隆實(shí)驗(yàn)（Colony formation assay）檢測(cè)細(xì)胞克隆形成能力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，消化后計(jì)數(shù)，每組平行設(shè)三個(gè)孔，細(xì)胞按500個(gè)/孔接種于6孔板中。24 h后加入含Brucine 150、300 μM的1640培養(yǎng)基，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組和DMSO對(duì)照組，藥物干預(yù)48 h后，更換為無(wú)藥物的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)7 d，用2%結(jié)晶紫染色，并拍照統(tǒng)計(jì)。

1.2.3 PI染色檢測(cè)細(xì)胞周期 收集對(duì)照組及處理組細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗2次，棄上清，用預(yù)冷70%乙醇制備成單細(xì)胞懸液，4oC固定。24 h后離心，棄上清，PBS漂洗2次，100 μL RNase A 37oC水浴30 min；再加入5 μL PI染色混勻，4oC避光30 min。用200目尼龍濾膜過(guò)濾后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用FlowJo7.6.1進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)出G0/G1期的細(xì)胞比例。

1.2.4 RNA的提取、反轉(zhuǎn)錄、實(shí)時(shí)熒光定量PCR 使用Trizol試劑盒提取對(duì)照和處理組細(xì)胞RNA，使用Bio-Rad的iScript cDNA Synthesis Kitd將抽得的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。取反轉(zhuǎn)產(chǎn)物3 μL作為模板，用SYBR Premix Ex Taq II試劑盒（TaKaRa公司）進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，以GAPDH為內(nèi)參，采用引物如下（5’-3’）（北京生命科學(xué)研究所生物制品中心合成）：Cyclin D1(human) Forward：CCGTCCATGCGGAAGAT；Reverse：ATGGCCAGCGGGAAGAC。Cyclin E(human)Forward：ACCAGTTTGCGTATGTG；Reverse：TGTGGGTCTGTATGTTGTG。GAPDH(human) Forward：TGACAACTTTGGTATYCGTGGAAGG；Reverse：AGGCAGGGATGATGTTCTGGAGAG。所有反應(yīng)采用3復(fù)孔，采用7500Fast Real-Time PCR System進(jìn)行檢測(cè)，反應(yīng)條件為預(yù)變性95oC 2 min；PCR反應(yīng)95oC 10 s；60oC 15 s，40個(gè)循環(huán)。溶解曲線設(shè)置：Melt curve：65.0oC-95.0oC，increment 0.5oC for 0.05 min+plate read。按照2-ΔΔCt法計(jì)算出各基因相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 Western blot檢測(cè) 用裂解液處理收集細(xì)胞，以蛋白提取液樣品作SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜，封閉后加入一抗（抗體稀釋濃度為1:800），4oC過(guò)夜，TBST洗膜4 次，每次10 min；加入二抗（抗體稀釋濃度為1:5,000），TBST洗4 次，每次10 min；浸于適量ECL化學(xué)發(fā)光試劑中（A液:B液=1:1）3 min， 取出，室溫條件下干燥并用保鮮膜包置于暗盒中，壓片曝光3 min-10 min，洗片。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析，以Mean±SD表示，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表 1 不同濃度Brucine干預(yù)PC-9 CellTiter-Glo結(jié)果Tab 1 CellTiter-Glo results of defferent concerntration of Brucine inhibiting PC-9

2 結(jié)果

2.1 Brucine抑制PC-9細(xì)胞的生長(zhǎng)（表1） 由表1可知，PC-9細(xì)胞被不同濃度的Brucine處理24 h、48 h、72 h后，細(xì)胞活力隨著作用濃度的升高以及作用時(shí)間的延長(zhǎng)而明顯降低，Brucine對(duì)其增殖抑制作用越來(lái)越強(qiáng)，且抑制的程度與作用的濃度和時(shí)間成正相關(guān)。用藥組與對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），但DMSO組與對(duì)照組相比P＞0.05。用直線回歸法測(cè)得24 h、48 h、72 h的IC50分別為555.3 μM、251.5 μM、136.6 μM。

2.2 Brucine對(duì)肺癌細(xì)胞PC-9集落形成能力的影響（圖1）各組PC-9細(xì)胞分別干預(yù)48 h后，更換為無(wú)藥物的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)7 d，用2%結(jié)晶紫染色，于顯微鏡下觀察直徑≥200 μm的克隆數(shù)，結(jié)果顯示：對(duì)照組、DMSO組、150 μM Brucine組、300 μM Brucine組相對(duì)克隆形成率分別為：1.00±0.03、0.99±0.02、0.42±0.02、0.12±0.02。用藥組與對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01) ，但DMSO組與對(duì)照組相比P＞0.05。

2.3 Brucine對(duì)肺癌細(xì)胞PC-9周期的影響（圖2） 對(duì)照組、DMSO組、150 μM Brucine組、300 μM Brucine組處于細(xì)胞周期G0/G1所占細(xì)胞比例分別為：56.82±0.59、56.02±0.50、61.09±0.25、70.31±0.55。用藥組與對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01) ，但DMSO組與對(duì)照組相比P＞0.05。結(jié)果表明Brucine能將增殖過(guò)程中的PC-9細(xì)胞阻滯于G0/G1期。

2.4 Brucine對(duì)PC-9細(xì)胞Cyclin D1、Cyclin E mRNA表達(dá)的影響（圖3） qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，DMSO組、150 μM Brucine組、300 μM Brucine組中Cyclin D1、Cyclin E的相對(duì)表達(dá)分別為：0.99±0.01、0.99±0.01；0.39±0.14、0.27±0.02；0.26±0.13、0.11±0.00。除DMSO組與對(duì)照組相比P＞0.05之外，其余用藥組與對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。以上結(jié)果表明Brucine能明顯地下調(diào)細(xì)胞周期相關(guān)基因Cyclin D1、Cyclin E mRNA的表達(dá)，且隨著藥物濃度增高，其下調(diào)基因的程度也增加。

2.5 Western blot檢測(cè)結(jié)果（圖4） 分別收集各對(duì)照和處理組細(xì)胞，提取總蛋白，檢測(cè)周期相關(guān)基因Cyclin D1、Cyclin E蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，隨著B(niǎo)rucine濃度的增高，細(xì)胞周期相關(guān)基因Cyclin D1、Cyclin E蛋白表達(dá)水平逐漸降低。

3 討論

最近研究證實(shí)，腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)多因素影響的復(fù)雜過(guò)程[17]，涉及多種基因和蛋白的表達(dá)異常，但其最終表現(xiàn)均為細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制紊亂、細(xì)胞分化受阻[18]。增殖是指細(xì)胞通過(guò)分裂而生成與自身相同的細(xì)胞群體的過(guò)程。腫瘤細(xì)胞的增殖周期與正常細(xì)胞一樣，要經(jīng)過(guò)G0/G1期、S期、G2/M期等3個(gè)時(shí)期才能完成一次細(xì)胞的增殖過(guò)程，任何能阻斷這4期中的一期或多期的藥物都能有效地抑制腫瘤細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)[19]。目前已發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞周期調(diào)控因子主要有細(xì)胞周期蛋白（Cyclin）、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin dependent kinase, CDK）、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑（cyclin-dependent kinase inhibitors,CKI），其中CDK是該調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的核心，Cyclin對(duì)CDK有正調(diào)控作用，在Cyclin系列中，以Cyclin D1研究最多最深入。其為細(xì)胞周期中G1期進(jìn)入S期的一個(gè)首要調(diào)控因子，通過(guò)激活CDK4或CDK6等作用，促進(jìn)DNA合成，加速細(xì)胞增殖[20]。而在細(xì)胞周期中，直接控制細(xì)胞周期是否由G1期進(jìn)入S期的重要因子為Cyclin E，研究[21,22]發(fā)現(xiàn)，向細(xì)胞內(nèi)注射Cyclin E的抗體能使細(xì)胞停滯于G1期，說(shuō)明細(xì)胞進(jìn)入S期需要Cyclin E的參與。其與CDK2結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞通過(guò)G1/S限制點(diǎn)而進(jìn)入S期。如果Cyclin E合成增加或降解減少，或者Cyclin D1過(guò)度表達(dá)使細(xì)胞周期G1/S轉(zhuǎn)換時(shí)間縮短，將導(dǎo)致細(xì)胞周期加快，腫瘤惡性增生。因此，設(shè)法阻滯腫瘤細(xì)胞的周期進(jìn)程已成為一種新的治療方向。

圖 1 馬錢子堿抑制人肺癌細(xì)胞株P(guān)C-9克隆形成。A：對(duì)照；B：DMSO；C：150 μM；D: 300 μM。與對(duì)照組比較，**：P＜0.01。Fig 1 Brucine inhibited the colony formation of human lung cancer cell line PC-9. A: control；B: DMSO; C: 150 μM；D: 300 μM. Compared with control, **: P＜0.01.

圖 2 馬錢子堿阻滯人肺癌細(xì)胞株P(guān)C-9于G0/G1期。A：對(duì)照；B：DMSO；C：150 μM；D：300 μM。與對(duì)照組比較，**：P＜0.01。Fig 2 Brucine blocked the cell cycle at G0/G1 in human lung cancer cell line PC-9. A: control; B:DMSO; C: 150 μM; D: 300 μM. Compared with control, **: P＜0.01.

圖 3 馬錢子堿下調(diào)肺癌細(xì)胞株P(guān)C-9周期相關(guān)基因Cyclin D1、Cyclin E mRNA表達(dá)。與對(duì)照組比較，**：P＜0.01。Fig 3 Expression of cell cycle regulators Cyclin D1, Cyclin E mRNA were down-regulated in human lung cancer cell line PC-9 by Brucine.Compared with control, **: P＜0.01.

圖 4 Brucine下調(diào)肺癌細(xì)胞株P(guān)C-9周期相關(guān)基因Cyclin D1、Cyclin E蛋白表達(dá). 與對(duì)照組比較，**：P＜0.01。Fig 4 Protein expressions of cell cycle regulators Cyclin D1, Cyclin E were down-regulated in human lung cancer cell line PC-9 by Brucine. Compared with control, **: P＜0.01.

目前已發(fā)現(xiàn)許多通過(guò)阻滯細(xì)胞周期起到抗腫瘤作用的藥物，但是這些藥物往往因?yàn)楦弊饔幂^多及癌癥患者對(duì)其迅速產(chǎn)生的耐藥性而限制了其在臨床上的運(yùn)用，尤其對(duì)于EGFR突變型肺癌，其已對(duì)多種化療藥物產(chǎn)生耐藥，即使靶向治療踏上了治療EGFR突變型肺癌的舞臺(tái)，但是終究因?yàn)槟退帯r(jià)格等各種原因無(wú)法普及到每一位EGFR突變型肺癌，因此尋找一種抗EGFR突變型肺癌細(xì)胞且易于被患者接受的藥物已成為目前研究的熱點(diǎn)。中藥單體Brucine因?yàn)槠鋸V泛抗腫瘤作用而被人熟知，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)[23]發(fā)現(xiàn)Brucine可明顯抑制小鼠肉瘤、黑色素瘤、肺癌等的生長(zhǎng)；體外實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)白血病細(xì)胞K562和胃癌C85、HL60、肝癌SMMC-7721、Hep-G2可被其直接抑制；另外現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為腫瘤的發(fā)生與人體的免疫監(jiān)視作用失敗有關(guān)，諸多化療藥物耐藥性的產(chǎn)生也與其損傷機(jī)體免疫系統(tǒng)有密切關(guān)系，而曲雷鳴等[24]發(fā)現(xiàn)Brucine不僅不會(huì)對(duì)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生不良影響，而且在與其他化療藥物聯(lián)合抗癌時(shí)反而具有增強(qiáng)免疫功能的作用。即使Brucine的抗腫瘤作用廣泛，但對(duì)于EGFR突變型肺癌細(xì)胞的研究仍然是一個(gè)未知領(lǐng)域，因此本研究以EGFR突變型肺癌細(xì)胞PC-9為靶細(xì)胞，研究其對(duì)PC-9細(xì)胞增殖的影響。首先通過(guò)CellTiter-Glo發(fā)光法和平板克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察了Brucine對(duì)PC-9細(xì)胞的增殖抑制作用，結(jié)果表明Brucine可以濃度和時(shí)間依賴性地抑制PC-9細(xì)胞的增殖。其次為了探討B(tài)rucine對(duì)于PC-9細(xì)胞增殖抑制作用的機(jī)制，我們通過(guò)PI染核流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與對(duì)照組相比，Brucine可以濃度依賴性的把PC-9細(xì)胞阻滯在G1期，使之不進(jìn)入或延遲進(jìn)入S期，干擾了DNA的合成，并且在300 μM Brucine作用下發(fā)現(xiàn)有明顯的凋亡峰，這表明Brucine在導(dǎo)致細(xì)胞周期G1期阻滯時(shí)伴隨有細(xì)胞凋亡，加速抑制了細(xì)胞的增殖。為進(jìn)一步研究Brucine阻滯PC-9細(xì)胞周期進(jìn)程的分子機(jī)制，qRT-PCR、Western blot法檢測(cè)了Brucine對(duì)PC-9細(xì)胞周期相關(guān)基因Cyclin D1、Cyclin E轉(zhuǎn)錄及翻譯水平表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著B(niǎo)rucine濃度的提高，Cyclin D1、Cyclin E mRNA及蛋白表達(dá)水平降低。這表明Brucine可能是通過(guò)下調(diào)Cyclin D1、Cyclin E在EGFR突變型肺癌PC-9細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄及翻譯水平的表達(dá)來(lái)阻滯PC-9細(xì)胞于G0/G1期，這也同時(shí)從基因表達(dá)的角度反證了Cyclin D1、Cyclin E促進(jìn)細(xì)胞周期G1到S期的進(jìn)程。綜上所述，本研究成果為Brucine成為治療EGFR突變型肺癌的新型藥物提供理論基礎(chǔ)。