響應(yīng)面分析法對大火草多糖提取工藝的優(yōu)化

貝盞臨+張欣+曹君邁+雷茜+謝杏

摘要:采用超聲波和微波技術(shù)提取大火草[Anemone tomentosa(Maxim.)Péi]根?莖?葉中的多糖,確定超聲波醇提為最佳提取方法,用苯酚-硫酸法測定其多糖含量?通過單因素試驗和響應(yīng)面分析法,研究了料液比?溫度?提取時間對多糖提取率的影響?結(jié)果表明,提取時間和溫度是影響大火草多糖提取率的主要因素,試驗穩(wěn)定性?精密度良好,提取大火草多糖的最佳條件為溫度80 ℃,提取時間50 min,料液比1∶100(m∶V)?利用最佳提取工藝得到根?莖?葉中的多糖含量分別為5.16%?1.61%?7.16%?

關(guān)鍵字:大火草[Anemone tomentosa(Maxim.) Péi];多糖;響應(yīng)面分析法

中圖分類號:Q949.95文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A文章編號:0439-8114(2014)11-2616-04

Optimizing the Process of Extracting Polysaccharides from Anemoen tomentose(Maxim.) Péi by Response Surface Methodology

BEI Zhan-lin,ZHANG Xin,CAO Jun-mai,LEI Qian,XIE Xing

(Department of Biological Science and Engineering,Beifang University of Nationalities,Yinchuan 750021,China)

Abstract: The polysaccharides were extracted from the roots, stems and leaves of Anemone tomentosa(Maxim.) Péi with ultrasonic and microwave extraction. The ultrasound-assisted extraction with ethanol was the best method. Polysaccharides were measured by phenol-sulfuric acid method. The effects of material-liquid ratio, extraction temperature and time on the extraction of polysaccharides were studied with single-factor experiment and response surface methodology. The results showed that the temperature and the time were the main factors. The optimal condition of polysaccharides extraction was temperature of 80 ℃,extraction time of 50 min, material-liquid ratio of 1∶100(m∶V). Under the optimal conditions, the contents of polysaccharides in roots, stems and the leaves were 5.16%,1.61% and 7.16%,respectively.

Key words: Anemone tomentosa(Maxim.)Péi;polysaccharides;response surface methodology

收稿日期:2013-12-13

基金項目:國家民委生態(tài)系統(tǒng)模型及應(yīng)用重點實驗室項目(2010SY08)

作者簡介:貝盞臨(1975-),男,寧夏鹽地人,講師,碩士,主要從事普通生物學(xué)教學(xué)與科研工作,(電話)0951-2067893(電子信箱)

realpal00147@163.com?

大火草[Anemone tomentosa (Maxim.) Péi]為銀蓮花屬植物,具有很高的觀賞價值和抗炎活性等藥用價值[1,2]?銀蓮花屬植物具有抗腫瘤?抗炎?解熱鎮(zhèn)痛?抗驚厥等各種作用,尤其是治療前列腺和抗癌活性顯著[3,4],所以大火草的開發(fā)意義重大?本試驗通過對大火草不同部位多糖含量的測定,旨在找出其最佳提取工藝和多糖含量較為多的提取部位[5-7],為今后開發(fā)大火草提供參考依據(jù)?

1材料與方法

1.1材料

大火草:根?莖?葉均采于六盤山?

1.2試劑和儀器

95%乙醇?無水乙醇(北京北化精細(xì)化學(xué)品有限責(zé)任公司),苯酚?濃硫酸(北京化學(xué)試劑公司),丙酮(富宇精細(xì)化工有限公司),正丁醇(天津市化學(xué)試劑六廠分廠),石油醚(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司),三氯甲烷(萊陽市雙雙化工有限公司),以上試劑均為分析純;一級水(EASY pure型純水器純化)?

低速臺式大容量離心機(jī)(TDL-40B型,上海安亭科學(xué)儀器廠)?紫外可見分光光度計(UV765型,上海精密科學(xué)儀器有限公司)?數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-2型,國華電器有限公司)?高速萬能粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)?超生清洗器(KQ-500B型,昆山市超聲儀器有限公司)?微波爐WD700(MG-5061T1型,天津樂金電子電器有限公司)?Vortex振蕩器(QL-901型,其林貝爾儀器制造公司)?旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-52AA型,上海亞榮生化儀器廠)?

1.3方法

1.3.1材料前處理將大火草的根?莖?葉干樣粉碎,置于干燥箱中110 ℃恒溫干燥15 min,稱取根?莖?葉粉末各15 g,分別加入石油醚100 mL,采用索式回流脫脂?脫色1 h,通風(fēng)櫥中揮發(fā)石油醚;再用無水乙醇200 mL回流提取4 h,脫去醇溶性雜質(zhì)和色素;之后將各部位粉末用無水乙醇沖洗,干燥至恒重備用?

1.3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制配制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品,其濃度分別為0?0.01?0.03?0.05?0.07?0.10 mg/mL,在450~750 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描,檢測最大吸收峰波長為490 nm?在490 nm波長下測定葡萄糖的吸光度,以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?

1.3.3不同方法提取大火草多糖稱取前處理后的樣品0.1 g,分別置于4個小燒杯中,采用超聲波水提?超聲波乙醇提取?微波水提?微波乙醇提取4種方法提取?微波提取:分別用去離子水和80%乙醇以1∶100(m∶V,下同)料液比在微波爐中微波提取10 min?超聲波提取:分別用去離子水和80%乙醇以1∶100料液比在超聲波清洗儀里80 ℃超聲10 min?之后將4種提取液在4 000 r/min離心10 min取上清,加4倍量的95%乙醇至溶液乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%,醇沉后4 000 r/min離心10 min得到沉淀?沉淀用適量乙醇洗滌,再用去離子水溶解后離心去除不溶于水的雜質(zhì),定容至100 mL?

采用苯酚-硫酸法測定吸光度[8,9]:取上述4種提取液各1 mL,加入0.5 mL 9%苯酚溶液,緩慢加入2 mL濃硫酸?劇烈振蕩5 min,水浴加熱15 min后冰浴30 min,在波長490 nm下以去離子水為對照測定其吸光度,以下均采用此步驟測定吸光度?確定出最佳提取方法,再利用最佳提取方法進(jìn)行工藝優(yōu)化?

1.4最佳工藝的優(yōu)化

1.4.1單因素試驗稱取材料0.1 g,提取后于波長490 nm處測定其吸光度?采用苯酚-硫酸法測定各試驗處理液的吸光度,并比較各個條件下的提取效果?

1)溫度對大火草多糖提取率的影響?料液比 1∶40,超聲提取時間為20 min,分別在40?50?60?70?80 ℃條件下提取多糖,將提取液稀釋至接近透明(50倍左右)?

2)提取時間對大火草多糖提取率的影響?水浴溫度為80 ℃,料液比1∶40的條件下,分別提取10?20?30?40?50 min,將提取液稀釋后進(jìn)行測定?

3)料液比對大火草多糖提取率的影響?溫度為80 ℃,提取時間為30 min的條件下,分別以1∶20?1∶30?1∶40?1∶60?1∶80?1∶100的料液比提取多糖,將提取液稀釋后進(jìn)行測定?

1.4.2應(yīng)用響應(yīng)面分析法優(yōu)化超聲波提取工藝響應(yīng)面分析法是將體系的響應(yīng)(如萃取化學(xué)中的萃取率)作為一個或多個因素(如萃取劑濃度?酸度等)的函數(shù),運用圖形技術(shù)將這種函數(shù)關(guān)系顯示出來,選擇試驗設(shè)計中的最優(yōu)化條件?采用Design-Expert.8.05 b響應(yīng)面優(yōu)化分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,因素和水平見表1?運用所得最佳工藝分別提取大火草根?莖?葉中多糖并比較其含量?

2結(jié)果與分析

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

在490 nm波長下測定葡萄糖的吸光度,以萄糖濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1),得到的回歸方程為y=8.792 3x-0.015 5,R2=0.997 8,線性關(guān)系較好,可用來計算多糖的含量?

2.2提取方法的比較

采用超聲波水提?超聲波乙醇提取?微波水提?微波乙醇提取4種方法提取大火草中的多糖,其OD490 nm分別為0.141 1?0.288 3?0.031 1?0.146 6,其中超聲波乙醇提取法的OD490 nm最大,所以選擇此方法作為提取大火草中多糖的方法?

2.3單因素試驗結(jié)果

2.3.1溫度對大火草多糖提取率的影響在料液比1∶40,超聲波提取時間為20 min的條件下,改變提取溫度提取大火草多糖,在490 nm波長下測定其吸光度,結(jié)果見圖2?由圖2可知,大火草多糖提取的最適宜溫度為60~80 ℃?

2.3.2提取時間對大火草多糖提取率的影響 在水浴溫度為80 ℃,料液比1∶40的條件下,不同的超聲波提取時間對大火草多糖提取率的影響結(jié)果見圖3?由圖3可知,大火草多糖的提取時間選擇30~50 min為宜?

2.3.3料液比對大火草多糖提取率的影響溫度為80 ℃,提取時間為30 min的條件下,改變乙醇的添加量,提取大火草中的多糖,結(jié)果見圖4?由圖4可知,最適宜料液比為1∶100?

2.4穩(wěn)定性試驗

取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0.5 mL,置于10 mL容量瓶中,按照“1.3”中的方法,每隔0.5 h測定溶液吸光度,連續(xù)4 h,結(jié)果其吸光度基本無變化,樣品溶液的穩(wěn)定性良好?

2.5精密度試驗

吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液(0.03 mg/mL)6份,按照苯酚-硫酸法進(jìn)行處理,得到溶液的吸光度分別為0.262 5?0.262 3?0.261 8?0.263 8?0.262 1?0.259 6,求得RSD為5.12%?說明試驗精密度良好?

2.6響應(yīng)面分析法結(jié)果

根據(jù)Design-Expert.8.05b軟件分析各因素對大火草多糖提取率的影響,其中中間的等高線的斜率越大證明其對提取率的影響越大,得到各因素對提取率的影響大小順序為提取時間?溫度?料液比(圖5)?

當(dāng)一個因素的值一定時,另外兩個因素通過響應(yīng)面分析可以得到其影響的大小,結(jié)果如圖6?圖7?圖8所示?對料液比?溫度?提取時間進(jìn)行變換,A=(a-100)/10,B=(T-70)/10,C=(t-40)/10(a為實際料液比中的液體值;T為實際提取溫度;t為實際提取時間),以3次單因素試驗所得的多糖提取率的平均值為響應(yīng)值,試驗結(jié)果見表2,其中1~12號是析因試驗,13~16號是中心試驗?響應(yīng)面分析結(jié)果表明,選擇1號的組合為最佳組合,即料液比1∶100?溫度80 ℃?提取時間50 min?

稱取100 mg大火草原料,根據(jù)最佳工藝條件溫度80 ℃,料液比1∶100,提取時間50 min提取大火草根?莖?葉3個部位的多糖,進(jìn)行3個平行試驗,定容至100 mL后測定其吸光度?大火草根部OD490 nm分別為0.438 2?0.438 5?0.437 5,莖部OD490 nm分別為0.265 7?0.126 3?0.127 2,葉部分別為0.613 7?0.604 9?0.612 5?根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線可得到:大火草根?莖?葉的多糖平均含量分別為5.16%?1.61%?7.16%?

3小結(jié)與討論

在微波乙醇提取?微波水提?超聲波乙醇提取?超聲波水提4種提取方法中,超聲波乙醇提取法的提取效果較好,效率最高?隨著溫度的升高,多糖提取率不斷增大;隨著料液比的增大,提取率呈上升趨勢,因料液比越大,傳質(zhì)動力大,則提取得到的多糖越容易溶解,損失就越少;隨著提取時間的增加,多糖提取率在10~30 min明顯增加,30 min后隨著提取時間的延長,提取率變化不大?

苯酚-硫酸法雖然適合提取多糖,但只在一些特定的植物多糖提取中占有優(yōu)勢,而且在操作上還應(yīng)嚴(yán)格控制酸度,因為酸性條件下可能引起多糖中糖苷鍵的斷裂[10]?對于傳統(tǒng)方法提取時間長,提取溶劑用量多等缺點[11],本試驗采用超聲波和微波這種提取工藝進(jìn)行比較?研究表明,超聲波乙醇提取法為提取大火草中多糖較好的方法?對超聲波乙醇提取法進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果表明,最優(yōu)工藝為溫度80 ℃,料液比1∶100,提取時間50 min?采用最優(yōu)方案測定大火草根?莖?葉多糖的平均含量分別為5.16%?1.61%?7.16%,其中葉中多糖含量最高?

參考文獻(xiàn):

[1] 王俊儒,馬建琪,彭樹林,等.大火草化學(xué)成分及其拒食活性研究初報[J].西北植物學(xué)報,1998,18(4):643-644.

[2] 張祖帥.毛茛科大火草果實種子和發(fā)芽特性研究[J].山西水利,2008(6):31-32.

[3] 王莉,紅梅.壯藥大火草治療慢性盆腔炎的臨床應(yīng)用[J].中國民族醫(yī)藥雜志,2007(12):18.

[4] 紅梅.壯藥大火草治療泌尿系統(tǒng)感染的臨床應(yīng)用[J].中國民族醫(yī)藥雜志,2008(7):20.

[5] 張志良,瞿偉菁.植物生理學(xué)實驗指導(dǎo)[M].高等教育出版社,2003.

[6] 孫卓然,劉圓,李曉云,等.石斛不同種?不同藥用部位中多糖含量測定[J]. 時珍國醫(yī)國藥,2009,20(8):1886-1888.

[7] 王建壯,安潔,呂華沖.蛹蟲草子實體中多糖含量測定方法的研究[J].中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用,2008,2(15):19-20.

[8] 徐凌川.人工栽培泰山白首烏藥材總多糖含量測定[J].山東中醫(yī)雜志,2008,27(3):193-195.

[9] 叢媛媛,熱娜?卡斯木,帕麗達(dá)?阿不力孜,等.新疆脹果甘草多糖的提取及其體外抗氧化活性[J].中藥材,2009(9):32-33.

[10] 陳鳳清,叢建民.甘草多糖超聲提取工藝優(yōu)化研究[J].中國釀造,2009(1):138-142.

[11] 李紅,李炳奇,劉紅,等.甘草渣中黃酮和多糖的提取及含量測定[J].中國食品添加劑,2006(6):197-203.

1.4最佳工藝的優(yōu)化

1.4.1單因素試驗稱取材料0.1 g,提取后于波長490 nm處測定其吸光度?采用苯酚-硫酸法測定各試驗處理液的吸光度,并比較各個條件下的提取效果?

1)溫度對大火草多糖提取率的影響?料液比 1∶40,超聲提取時間為20 min,分別在40?50?60?70?80 ℃條件下提取多糖,將提取液稀釋至接近透明(50倍左右)?

2)提取時間對大火草多糖提取率的影響?水浴溫度為80 ℃,料液比1∶40的條件下,分別提取10?20?30?40?50 min,將提取液稀釋后進(jìn)行測定?

3)料液比對大火草多糖提取率的影響?溫度為80 ℃,提取時間為30 min的條件下,分別以1∶20?1∶30?1∶40?1∶60?1∶80?1∶100的料液比提取多糖,將提取液稀釋后進(jìn)行測定?

1.4.2應(yīng)用響應(yīng)面分析法優(yōu)化超聲波提取工藝響應(yīng)面分析法是將體系的響應(yīng)(如萃取化學(xué)中的萃取率)作為一個或多個因素(如萃取劑濃度?酸度等)的函數(shù),運用圖形技術(shù)將這種函數(shù)關(guān)系顯示出來,選擇試驗設(shè)計中的最優(yōu)化條件?采用Design-Expert.8.05 b響應(yīng)面優(yōu)化分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,因素和水平見表1?運用所得最佳工藝分別提取大火草根?莖?葉中多糖并比較其含量?

2結(jié)果與分析

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

在490 nm波長下測定葡萄糖的吸光度,以萄糖濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1),得到的回歸方程為y=8.792 3x-0.015 5,R2=0.997 8,線性關(guān)系較好,可用來計算多糖的含量?

2.2提取方法的比較

采用超聲波水提?超聲波乙醇提取?微波水提?微波乙醇提取4種方法提取大火草中的多糖,其OD490 nm分別為0.141 1?0.288 3?0.031 1?0.146 6,其中超聲波乙醇提取法的OD490 nm最大,所以選擇此方法作為提取大火草中多糖的方法?

2.3單因素試驗結(jié)果

2.3.1溫度對大火草多糖提取率的影響在料液比1∶40,超聲波提取時間為20 min的條件下,改變提取溫度提取大火草多糖,在490 nm波長下測定其吸光度,結(jié)果見圖2?由圖2可知,大火草多糖提取的最適宜溫度為60~80 ℃?

2.3.2提取時間對大火草多糖提取率的影響 在水浴溫度為80 ℃,料液比1∶40的條件下,不同的超聲波提取時間對大火草多糖提取率的影響結(jié)果見圖3?由圖3可知,大火草多糖的提取時間選擇30~50 min為宜?

2.3.3料液比對大火草多糖提取率的影響溫度為80 ℃,提取時間為30 min的條件下,改變乙醇的添加量,提取大火草中的多糖,結(jié)果見圖4?由圖4可知,最適宜料液比為1∶100?

2.4穩(wěn)定性試驗

取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0.5 mL,置于10 mL容量瓶中,按照“1.3”中的方法,每隔0.5 h測定溶液吸光度,連續(xù)4 h,結(jié)果其吸光度基本無變化,樣品溶液的穩(wěn)定性良好?

2.5精密度試驗

吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液(0.03 mg/mL)6份,按照苯酚-硫酸法進(jìn)行處理,得到溶液的吸光度分別為0.262 5?0.262 3?0.261 8?0.263 8?0.262 1?0.259 6,求得RSD為5.12%?說明試驗精密度良好?

2.6響應(yīng)面分析法結(jié)果

根據(jù)Design-Expert.8.05b軟件分析各因素對大火草多糖提取率的影響,其中中間的等高線的斜率越大證明其對提取率的影響越大,得到各因素對提取率的影響大小順序為提取時間?溫度?料液比(圖5)?

當(dāng)一個因素的值一定時,另外兩個因素通過響應(yīng)面分析可以得到其影響的大小,結(jié)果如圖6?圖7?圖8所示?對料液比?溫度?提取時間進(jìn)行變換,A=(a-100)/10,B=(T-70)/10,C=(t-40)/10(a為實際料液比中的液體值;T為實際提取溫度;t為實際提取時間),以3次單因素試驗所得的多糖提取率的平均值為響應(yīng)值,試驗結(jié)果見表2,其中1~12號是析因試驗,13~16號是中心試驗?響應(yīng)面分析結(jié)果表明,選擇1號的組合為最佳組合,即料液比1∶100?溫度80 ℃?提取時間50 min?

稱取100 mg大火草原料,根據(jù)最佳工藝條件溫度80 ℃,料液比1∶100,提取時間50 min提取大火草根?莖?葉3個部位的多糖,進(jìn)行3個平行試驗,定容至100 mL后測定其吸光度?大火草根部OD490 nm分別為0.438 2?0.438 5?0.437 5,莖部OD490 nm分別為0.265 7?0.126 3?0.127 2,葉部分別為0.613 7?0.604 9?0.612 5?根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線可得到:大火草根?莖?葉的多糖平均含量分別為5.16%?1.61%?7.16%?

3小結(jié)與討論

在微波乙醇提取?微波水提?超聲波乙醇提取?超聲波水提4種提取方法中,超聲波乙醇提取法的提取效果較好,效率最高?隨著溫度的升高,多糖提取率不斷增大;隨著料液比的增大,提取率呈上升趨勢,因料液比越大,傳質(zhì)動力大,則提取得到的多糖越容易溶解,損失就越少;隨著提取時間的增加,多糖提取率在10~30 min明顯增加,30 min后隨著提取時間的延長,提取率變化不大?

苯酚-硫酸法雖然適合提取多糖,但只在一些特定的植物多糖提取中占有優(yōu)勢,而且在操作上還應(yīng)嚴(yán)格控制酸度,因為酸性條件下可能引起多糖中糖苷鍵的斷裂[10]?對于傳統(tǒng)方法提取時間長,提取溶劑用量多等缺點[11],本試驗采用超聲波和微波這種提取工藝進(jìn)行比較?研究表明,超聲波乙醇提取法為提取大火草中多糖較好的方法?對超聲波乙醇提取法進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果表明,最優(yōu)工藝為溫度80 ℃,料液比1∶100,提取時間50 min?采用最優(yōu)方案測定大火草根?莖?葉多糖的平均含量分別為5.16%?1.61%?7.16%,其中葉中多糖含量最高?

參考文獻(xiàn):

[1] 王俊儒,馬建琪,彭樹林,等.大火草化學(xué)成分及其拒食活性研究初報[J].西北植物學(xué)報,1998,18(4):643-644.

[2] 張祖帥.毛茛科大火草果實種子和發(fā)芽特性研究[J].山西水利,2008(6):31-32.

[3] 王莉,紅梅.壯藥大火草治療慢性盆腔炎的臨床應(yīng)用[J].中國民族醫(yī)藥雜志,2007(12):18.

[4] 紅梅.壯藥大火草治療泌尿系統(tǒng)感染的臨床應(yīng)用[J].中國民族醫(yī)藥雜志,2008(7):20.

[5] 張志良,瞿偉菁.植物生理學(xué)實驗指導(dǎo)[M].高等教育出版社,2003.

[6] 孫卓然,劉圓,李曉云,等.石斛不同種?不同藥用部位中多糖含量測定[J]. 時珍國醫(yī)國藥,2009,20(8):1886-1888.

[7] 王建壯,安潔,呂華沖.蛹蟲草子實體中多糖含量測定方法的研究[J].中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用,2008,2(15):19-20.

[8] 徐凌川.人工栽培泰山白首烏藥材總多糖含量測定[J].山東中醫(yī)雜志,2008,27(3):193-195.

[9] 叢媛媛,熱娜?卡斯木,帕麗達(dá)?阿不力孜,等.新疆脹果甘草多糖的提取及其體外抗氧化活性[J].中藥材,2009(9):32-33.

[10] 陳鳳清,叢建民.甘草多糖超聲提取工藝優(yōu)化研究[J].中國釀造,2009(1):138-142.

[11] 李紅,李炳奇,劉紅,等.甘草渣中黃酮和多糖的提取及含量測定[J].中國食品添加劑,2006(6):197-203.

1.4最佳工藝的優(yōu)化

1.4.1單因素試驗稱取材料0.1 g,提取后于波長490 nm處測定其吸光度?采用苯酚-硫酸法測定各試驗處理液的吸光度,并比較各個條件下的提取效果?

1)溫度對大火草多糖提取率的影響?料液比 1∶40,超聲提取時間為20 min,分別在40?50?60?70?80 ℃條件下提取多糖,將提取液稀釋至接近透明(50倍左右)?

2)提取時間對大火草多糖提取率的影響?水浴溫度為80 ℃,料液比1∶40的條件下,分別提取10?20?30?40?50 min,將提取液稀釋后進(jìn)行測定?

3)料液比對大火草多糖提取率的影響?溫度為80 ℃,提取時間為30 min的條件下,分別以1∶20?1∶30?1∶40?1∶60?1∶80?1∶100的料液比提取多糖,將提取液稀釋后進(jìn)行測定?

1.4.2應(yīng)用響應(yīng)面分析法優(yōu)化超聲波提取工藝響應(yīng)面分析法是將體系的響應(yīng)(如萃取化學(xué)中的萃取率)作為一個或多個因素(如萃取劑濃度?酸度等)的函數(shù),運用圖形技術(shù)將這種函數(shù)關(guān)系顯示出來,選擇試驗設(shè)計中的最優(yōu)化條件?采用Design-Expert.8.05 b響應(yīng)面優(yōu)化分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,因素和水平見表1?運用所得最佳工藝分別提取大火草根?莖?葉中多糖并比較其含量?

2結(jié)果與分析

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

在490 nm波長下測定葡萄糖的吸光度,以萄糖濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1),得到的回歸方程為y=8.792 3x-0.015 5,R2=0.997 8,線性關(guān)系較好,可用來計算多糖的含量?

2.2提取方法的比較

采用超聲波水提?超聲波乙醇提取?微波水提?微波乙醇提取4種方法提取大火草中的多糖,其OD490 nm分別為0.141 1?0.288 3?0.031 1?0.146 6,其中超聲波乙醇提取法的OD490 nm最大,所以選擇此方法作為提取大火草中多糖的方法?

2.3單因素試驗結(jié)果

2.3.1溫度對大火草多糖提取率的影響在料液比1∶40,超聲波提取時間為20 min的條件下,改變提取溫度提取大火草多糖,在490 nm波長下測定其吸光度,結(jié)果見圖2?由圖2可知,大火草多糖提取的最適宜溫度為60~80 ℃?

2.3.2提取時間對大火草多糖提取率的影響 在水浴溫度為80 ℃,料液比1∶40的條件下,不同的超聲波提取時間對大火草多糖提取率的影響結(jié)果見圖3?由圖3可知,大火草多糖的提取時間選擇30~50 min為宜?

2.3.3料液比對大火草多糖提取率的影響溫度為80 ℃,提取時間為30 min的條件下,改變乙醇的添加量,提取大火草中的多糖,結(jié)果見圖4?由圖4可知,最適宜料液比為1∶100?

2.4穩(wěn)定性試驗

取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0.5 mL,置于10 mL容量瓶中,按照“1.3”中的方法,每隔0.5 h測定溶液吸光度,連續(xù)4 h,結(jié)果其吸光度基本無變化,樣品溶液的穩(wěn)定性良好?

2.5精密度試驗

吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液(0.03 mg/mL)6份,按照苯酚-硫酸法進(jìn)行處理,得到溶液的吸光度分別為0.262 5?0.262 3?0.261 8?0.263 8?0.262 1?0.259 6,求得RSD為5.12%?說明試驗精密度良好?

2.6響應(yīng)面分析法結(jié)果

根據(jù)Design-Expert.8.05b軟件分析各因素對大火草多糖提取率的影響,其中中間的等高線的斜率越大證明其對提取率的影響越大,得到各因素對提取率的影響大小順序為提取時間?溫度?料液比(圖5)?

當(dāng)一個因素的值一定時,另外兩個因素通過響應(yīng)面分析可以得到其影響的大小,結(jié)果如圖6?圖7?圖8所示?對料液比?溫度?提取時間進(jìn)行變換,A=(a-100)/10,B=(T-70)/10,C=(t-40)/10(a為實際料液比中的液體值;T為實際提取溫度;t為實際提取時間),以3次單因素試驗所得的多糖提取率的平均值為響應(yīng)值,試驗結(jié)果見表2,其中1~12號是析因試驗,13~16號是中心試驗?響應(yīng)面分析結(jié)果表明,選擇1號的組合為最佳組合,即料液比1∶100?溫度80 ℃?提取時間50 min?

稱取100 mg大火草原料,根據(jù)最佳工藝條件溫度80 ℃,料液比1∶100,提取時間50 min提取大火草根?莖?葉3個部位的多糖,進(jìn)行3個平行試驗,定容至100 mL后測定其吸光度?大火草根部OD490 nm分別為0.438 2?0.438 5?0.437 5,莖部OD490 nm分別為0.265 7?0.126 3?0.127 2,葉部分別為0.613 7?0.604 9?0.612 5?根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線可得到:大火草根?莖?葉的多糖平均含量分別為5.16%?1.61%?7.16%?

3小結(jié)與討論

在微波乙醇提取?微波水提?超聲波乙醇提取?超聲波水提4種提取方法中,超聲波乙醇提取法的提取效果較好,效率最高?隨著溫度的升高,多糖提取率不斷增大;隨著料液比的增大,提取率呈上升趨勢,因料液比越大,傳質(zhì)動力大,則提取得到的多糖越容易溶解,損失就越少;隨著提取時間的增加,多糖提取率在10~30 min明顯增加,30 min后隨著提取時間的延長,提取率變化不大?

苯酚-硫酸法雖然適合提取多糖,但只在一些特定的植物多糖提取中占有優(yōu)勢,而且在操作上還應(yīng)嚴(yán)格控制酸度,因為酸性條件下可能引起多糖中糖苷鍵的斷裂[10]?對于傳統(tǒng)方法提取時間長,提取溶劑用量多等缺點[11],本試驗采用超聲波和微波這種提取工藝進(jìn)行比較?研究表明,超聲波乙醇提取法為提取大火草中多糖較好的方法?對超聲波乙醇提取法進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果表明,最優(yōu)工藝為溫度80 ℃,料液比1∶100,提取時間50 min?采用最優(yōu)方案測定大火草根?莖?葉多糖的平均含量分別為5.16%?1.61%?7.16%,其中葉中多糖含量最高?

參考文獻(xiàn):

[1] 王俊儒,馬建琪,彭樹林,等.大火草化學(xué)成分及其拒食活性研究初報[J].西北植物學(xué)報,1998,18(4):643-644.

[2] 張祖帥.毛茛科大火草果實種子和發(fā)芽特性研究[J].山西水利,2008(6):31-32.

[3] 王莉,紅梅.壯藥大火草治療慢性盆腔炎的臨床應(yīng)用[J].中國民族醫(yī)藥雜志,2007(12):18.

[4] 紅梅.壯藥大火草治療泌尿系統(tǒng)感染的臨床應(yīng)用[J].中國民族醫(yī)藥雜志,2008(7):20.

[5] 張志良,瞿偉菁.植物生理學(xué)實驗指導(dǎo)[M].高等教育出版社,2003.

[6] 孫卓然,劉圓,李曉云,等.石斛不同種?不同藥用部位中多糖含量測定[J]. 時珍國醫(yī)國藥,2009,20(8):1886-1888.

[7] 王建壯,安潔,呂華沖.蛹蟲草子實體中多糖含量測定方法的研究[J].中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用,2008,2(15):19-20.

[8] 徐凌川.人工栽培泰山白首烏藥材總多糖含量測定[J].山東中醫(yī)雜志,2008,27(3):193-195.

[9] 叢媛媛,熱娜?卡斯木,帕麗達(dá)?阿不力孜,等.新疆脹果甘草多糖的提取及其體外抗氧化活性[J].中藥材,2009(9):32-33.

[10] 陳鳳清,叢建民.甘草多糖超聲提取工藝優(yōu)化研究[J].中國釀造,2009(1):138-142.

[11] 李紅,李炳奇,劉紅,等.甘草渣中黃酮和多糖的提取及含量測定[J].中國食品添加劑,2006(6):197-203.