瞬時(shí)受體電位香草酸亞型1受體及C-C趨化因子受體2在鹽敏感性高血壓所致腎臟損害中的作用

朱飛云，劉衛(wèi)紅，王小曉，崔 琳，沈 思，朱明軍，王幼平河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室及心臟中心，鄭州450000

2河南中醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合臨床學(xué)科，鄭州450008

除糖尿病外，高血壓是導(dǎo)致終末期腎臟病的主要疾病之一［1］。研究證實(shí)，以單核/巨噬細(xì)胞浸潤為主的炎癥反應(yīng)在鹽敏感性高血壓所致的腎臟損害中發(fā)揮著重要作用［2］。在病理狀態(tài)下，白細(xì)胞中的單核細(xì)胞與其相應(yīng)的趨化因子相互作用促使其滲出并向炎癥部位聚集，構(gòu)成慢性炎癥反應(yīng)的主要病理變化。單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)屬于C-C趨化因子家族，與單核/巨噬細(xì)胞表面的C-C趨化因子受體2(C-C chemokine receptor 2，CCR2)相互作用，可誘發(fā)以單核/巨噬細(xì)胞浸潤為主的炎癥反應(yīng)［3］。研究證實(shí)，使用CCR2阻斷劑可明顯抑制糖尿病等多種疾病引起的腎臟損害［4-5］。瞬時(shí)受體電位香草酸亞型1(transient receptor potential vanilloid type 1，TRPV1)受體是一種非選擇性陽離子通道，可被多種刺激所激活，如高溫 (＞42℃)、低pH值和辣椒素等［6］。表達(dá)TRPV1受體的末梢感覺神經(jīng)纖維廣泛分布于血管外膜及腎臟。當(dāng)TRPV1受體被激活后，可導(dǎo)致末梢感覺神經(jīng)纖維釋放降鈣素基因相關(guān)肽和P物質(zhì)，造成血管擴(kuò)張［6］。筆者以往研究發(fā)現(xiàn)，由醋酸脫氧皮質(zhì)酮 (deoxycorticosterone acetate，DOCA)和鹽誘發(fā)的鹽敏感性高血壓在TRPV1基因敲除 (TRPV1-/-)小鼠中可造成明顯的腎臟損害，同時(shí)伴有大量單核/巨噬細(xì)胞浸潤［2］，提示在鹽敏感性高血壓過程中，TRPV1基因缺陷所介導(dǎo)的腎臟損害與單核/巨噬細(xì)胞的浸潤密切相關(guān)，但其具體分子生物學(xué)機(jī)制尚不明確。本研究采用TRPV1-/-小鼠，觀察了在鹽敏感性高血壓過程中CCR2阻斷劑對(duì)TRPV1基因缺陷所介導(dǎo)的腎臟功能和形態(tài)學(xué)損害的影響，以期闡明TRPV1受體和CCR2在鹽敏感性高血壓所誘導(dǎo)的腎臟損害中的相互作用。

材料和方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑清潔級(jí)雄性C57BL/6小鼠 (周齡8～9周)為野生型小鼠 ［北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)SCXK(京)2011-0011］，TRPV1-/-小鼠 (南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所)與C57BL/6小鼠回交至少6代以上所產(chǎn)雄性TRPV1-/-小鼠 (周齡8～9周)用于本實(shí)驗(yàn)。CCR2阻斷劑RS504393(美國Tocris Bioscience公司)，DOCA片 (美國 Innovative Research of America公司)，ELISA尿白蛋白試劑盒(美國 Exocell公司)，改良的 Jaffe肌酐測(cè)定試劑盒(美國BioAssay System公司)，尿8-異構(gòu)前列腺素試劑盒 (美國Cayman Chemical公司)，大鼠抗小鼠F4/80單克隆抗體 (1∶400，英國Serotec公司)和大鼠IgG(1∶400，美國 Vector Laboratories公司)。

造模及分組野生型及TRPV1-/-小鼠共為74只，分別分為假手術(shù)組 (野生型假手術(shù)組組和TRPV1-/-假手術(shù)組，n均=7)、DOCA-鹽高血壓組 (野生型DOCA-鹽高血壓組和TRPV1-/-DOCA-鹽高血壓組，n均=8)和DOCA-鹽高血壓-RS504393組 (野生型DOCA-鹽高血壓-RS504393組和TRPV1-/-DOCA-鹽高血壓-RS504393組，n均=8)。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室建立的實(shí)驗(yàn)方法建立DOCA-鹽高血壓小鼠模型［7］。具體如下:經(jīng)皮下注射混合麻醉劑［氯氨酮 (80 mg/kg)+甲苯噻嗪(4 mg/kg)］，常規(guī)切除左側(cè)腎臟，于小鼠頸部皮下植入DOCA片，術(shù)后給予含1%NaCl和0.2%KCl的飲用水，持續(xù)4周。假手術(shù)組小鼠僅摘除左側(cè)腎臟，但不植入DOCA片，給予正常飲用水。DOCA-鹽高血壓組給予皮下注射RS504393的溶媒;DOCA-鹽高血壓-RS504393組給予特異性的CCR2阻斷劑RS504393，RS504393溶于含有5%二甲基亞砜的生理鹽水，皮下注射，2 mg/kg，每日2次，持續(xù)4周。預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與無任何處理的假手術(shù)小鼠比較，接受RS504393溶媒或RS504393處理的野生型或TRPV1-/-假手術(shù)小鼠血流動(dòng)力學(xué)、腎臟功能和腎臟形態(tài)學(xué)指標(biāo)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P均＞0.05)，因此該部分?jǐn)?shù)據(jù)由無任何處理的假手術(shù)組代表。術(shù)后所有小鼠連續(xù)3 d肌肉注射青霉素鈉鹽。觀察4周。

動(dòng)脈收縮壓測(cè)定分別于術(shù)前及術(shù)后各周，根據(jù)Tail-cuff體積描記法原理，利用BP-2000型血壓測(cè)定儀 (美國Visitech System公司)測(cè)定清醒小鼠尾動(dòng)脈收縮壓。測(cè)定時(shí)間為上午10∶00～12∶00。小鼠在30℃電毯上安靜加熱10 min后，固定器固定，待小鼠穩(wěn)定后連續(xù)測(cè)定尾動(dòng)脈收縮壓5次，取其平均值。

尿樣及血漿分析于術(shù)后第26天，將小鼠放入代謝籠，適應(yīng)1 d后收集24 h尿液，稱體重。于術(shù)后第28天皮下注射混合麻醉劑麻醉小鼠，經(jīng)腹主動(dòng)脈采血，在4℃條件下離心10 min(4000×g)，取血漿保存于-80℃。尿白蛋白用ELISA試劑盒測(cè)定，尿及血漿中肌酐濃度用改良的Jaffe肌酐測(cè)定試劑盒測(cè)定，尿8-異構(gòu)前列腺素用特異性試劑盒測(cè)定。

腎臟病理組織學(xué)分析摘除右腎，稱重，置于4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋。對(duì)石蠟包埋組織切片 (厚度4 μm)進(jìn)行過碘酸-雪夫 (periodic acid-Schiff，PAS)染色和Masson三色染色。由1位不了解實(shí)驗(yàn)情況的病理學(xué)研究人員，根據(jù)筆者已發(fā)表的方法［7］，分析評(píng)估腎小球硬化和腎小管間質(zhì)損傷程度，根據(jù)腎小球硬化范圍、腎小管間質(zhì)損傷及炎癥細(xì)胞浸潤程度進(jìn)行半定量分析。

免疫組織化學(xué)染色分析采用卵白素-生物素復(fù)合物技術(shù)對(duì)單核/巨噬細(xì)胞標(biāo)記物F4/80進(jìn)行染色。常規(guī)處理石蠟包埋組織切片后，加入大鼠抗小鼠F4/80單克隆抗體，4℃下孵育12 h，沖洗，然后加入生物素標(biāo)記的抗大鼠IgG，室溫下孵育1 h后加卵白素-生物素復(fù)合物，室溫孵育45 min，加入fast red顯色液(美國Vector Laboratories公司)，顯微鏡下觀察控制染色。采用正常大鼠血清或去除第一抗體的方法作為陰性對(duì)照。根據(jù)筆者發(fā)表的方法［7］，每張切片隨機(jī)選取15個(gè)高倍視野 (×400)計(jì)數(shù)F4/80陽性細(xì)胞，取其平均值。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用Prism 5.0統(tǒng)計(jì)軟件，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間血壓差異比較采用兩因素方差分析 (Two-way ANOVA和Bonferroni檢驗(yàn))，多組間差異采用單因素方差分析 (One-way ANOVA和Bonferroni檢驗(yàn))，均為雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

各組小鼠血壓各組術(shù)前基礎(chǔ)血壓差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)。術(shù)后野生型假手術(shù)組和TRPV1-/-假手術(shù)組小鼠血壓平穩(wěn)，而術(shù)后第1周其余各組小鼠血壓與相應(yīng)的假手術(shù)組比較均明顯升高 (P均＜0.05)，并且于術(shù)后第3、4周達(dá)高峰。DOCA-鹽高血壓組和DOCA-鹽高血壓-RS504393組的血壓差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)，并且各組內(nèi)野生型小鼠和TRPV1-/-小鼠的血壓差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)(圖1)。

尿白蛋白排泄量及肌酐清除率各組小鼠體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)(表1)。與相應(yīng)的假手術(shù)組比較，野生型 DOCA-鹽高血壓組和 TRPV1-/-DOCA-鹽高血壓組的腎臟重量 (mg/10 g體重)和24 h尿白蛋白排泄量均顯著增加 (P均＜0.05)，而肌酐清除率顯著下降 (P＜0.05)。與相應(yīng)的DOCA-鹽高血壓組比較，RS504393處理組的24 h尿白蛋白排泄量顯著降低而肌酐清除率顯著升高 (P均＜0.05)。

尿8-異構(gòu)前列腺素排泄量與相應(yīng)的假手術(shù)組比較，野生型DOCA-鹽高血壓組和TRPV1-/-DOCA-鹽高血壓組的24 h尿8-異構(gòu)前列腺素排泄量均顯著增加(P＜0.05)，并且TRPV1-/-DOCA-鹽高血壓組的排泄量顯著高于野生型DOCA-鹽高血壓組 (P＜0.05)(圖2)。與相應(yīng)的DOCA-鹽高血壓組相比較，RS504393處理組的24 h尿8-異構(gòu)前列腺素排泄量明顯降低(P＜0.05)。

圖1 各組小鼠收縮壓比較Fig 1 Comparison of systolic blood pressure of mice in different groups

表1 各組小鼠體重及腎臟相關(guān)參數(shù)的變化 (x±s)Table 1 Body weights and renal parameters in mice in different groups(x±s)

腎臟病理組織學(xué)野生型DOCA-鹽高血壓組小鼠可見明顯腎小球硬化，其腎小球硬化指數(shù)顯著高于相應(yīng)的假手術(shù)組 (P＜0.05)，且TRPV1-/-DOCA-鹽高血壓組的腎小球硬化指數(shù)顯著高于野生型DOCA-鹽高血壓組 (P＜0.05)(圖3、4)。RS504393處理組的腎小球硬化指數(shù)均顯著低于相應(yīng)的 DOCA-鹽高血壓組(P＜0.05)。野生型DOCA-鹽高血壓組小鼠的腎小管間質(zhì)損傷程度顯著高于假手術(shù)組，主要表現(xiàn)為腎小管上皮細(xì)胞萎縮和管腔擴(kuò)張及炎性細(xì)胞浸潤等 (圖5、6)，TRPV1-/-DOCA-鹽高血壓組的腎小管間質(zhì)損傷程度顯著高于野生型DOCA-鹽高血壓組。RS504393處理的小鼠腎小管間質(zhì)損傷程度顯著低于相應(yīng)的DOCA-鹽高血壓組 (P＜0.05)。

圖2 各組小鼠尿8-異構(gòu)前列腺素24 h排泄量Fig 2 24 h urinary excretion of 8-isoprostane in mice in different groups

圖3 各組小鼠腎臟組織PAS染色 (×400)Fig 3 Periodic acid-Schiff stain of mice renal tissues in different groups(×400)

圖4 各組腎小球硬化指數(shù)變化Fig 4 Indexes of glomerulosclerosis in different groups

圖5 各組小鼠腎臟組織Masson染色 (×200)Fig 5 Masson’s stain of mice renal tissues in different groups(×200)

免疫組織化學(xué)染色與假手術(shù)組比較，F(xiàn)4/80陽性的單核/巨噬細(xì)胞浸潤數(shù)量在野生型和 TRPV1-/-DOCA-鹽高血壓組腎臟中顯著增加 (P＜0.05)，且TRPV1-/-DOCA-鹽高血壓組腎臟中的浸潤數(shù)量顯著高于野生型DOCA-鹽高血壓組 (P＜0.05)(圖7、8)。RS504393處理的小鼠F4/80陽性單核/巨噬細(xì)胞浸潤數(shù)量顯著低于相應(yīng)的DOCA-鹽高血壓組 (P＜0.05)。

圖6 各組小鼠腎小管間質(zhì)損傷分?jǐn)?shù)Fig 6 Scores of renal tubulointerstitial injury in different groups

圖7 各組小鼠腎臟F4/80陽性單核/巨噬細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色 (×400)Fig 7 F4/80-positive monocytes/macrophages in mice renal tissues in different groups as indicated by immunohistochemical stain(×400)

圖8 各組小鼠腎臟F4/80陽性單核/巨噬細(xì)胞數(shù)量變化Fig 8 Comparison of numbers of F4/80-positive monocytes/macrophages in mice renal tissues in different groups

討 論

本研究顯示，通過皮下包埋DOCA和飲用鹽水所誘發(fā)的鹽敏感性高血壓在野生型小鼠中可造成腎臟損害，主要表現(xiàn)為尿白蛋白增加、肌酐清除率下降、尿8-異構(gòu)前列腺素排泄增加、腎小球硬化和腎小管間質(zhì)損傷，其中腎小管間質(zhì)損傷包括腎小管上皮細(xì)胞萎縮、管腔擴(kuò)張及腎間質(zhì)單核/巨噬細(xì)胞浸潤等，以上腎臟損害的表現(xiàn)在TRPV1-/-小鼠中更為嚴(yán)重。在野生型小鼠和TRPV1-/-小鼠中，鹽敏感性高血壓所誘導(dǎo)的腎臟功能及形態(tài)學(xué)損害均被CCR2阻斷劑RS504393所抑制，且該作用在TRPV1-/-小鼠中更為突出。該結(jié)果提示CCR2介導(dǎo)鹽敏感性高血壓所誘導(dǎo)的腎臟損害，其機(jī)制可能是通過CCR2介導(dǎo)的單核/巨噬細(xì)胞浸潤。

在高血壓的發(fā)生發(fā)展過程中，血壓升高是造成腎臟損害的主要機(jī)制之一［8］。本研究結(jié)果顯示，野生型和TRPV1-/-DOCA-鹽高血壓組小鼠的血壓差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CCR2阻斷劑不影響皮下包埋DOCA和飲用鹽水所誘發(fā)的鹽敏感性高血壓，但可抑制和改善鹽敏感性高血壓造成的腎臟功能及形態(tài)學(xué)損害，并且該作用在TRPV1-/-小鼠中顯著增強(qiáng)。據(jù)此，筆者推測(cè)在野生型和TRPV1基因敲除小鼠CCR2阻斷劑對(duì)鹽敏感性高血壓所誘導(dǎo)的腎臟損害的保護(hù)作用可能主要是通過影響CCR2介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而非影響血壓。

研究表明，高血壓所誘導(dǎo)的腎臟損害往往與單核/巨噬細(xì)胞浸潤為主的炎癥反應(yīng)有關(guān)［2，9-10］。血中的白細(xì)胞，包括單核細(xì)胞，在其滲出、移動(dòng)和分化過程中涉及到多種環(huán)節(jié)和因素，在此過程中趨化因子發(fā)揮重要作用。在各種趨化因子中，MCP-1與單核/巨噬細(xì)胞表面的CCR2相互作用促使單核/巨噬細(xì)胞滲出、移動(dòng)和分化，從而形成以單核/巨噬細(xì)胞浸潤為主的炎癥反應(yīng)［3］。高鹽飲食可激活TRPV1受體，并且在鹽敏感性高血壓過程中，TRPV1基因缺陷進(jìn)一步加重該過程所誘發(fā)的腎臟損害，同時(shí)伴隨有大量的單核/巨噬細(xì)胞浸潤［2，11］，提示TRPV1受體可能通過抑制單核/巨噬細(xì)胞功能而緩解鹽敏感性高血壓所誘導(dǎo)的腎臟損害。本研究發(fā)現(xiàn)CCR2阻斷劑可抑制鹽敏感性高血壓造成的腎臟損害及單核/巨噬細(xì)胞浸潤，且該保護(hù)作用在TRPV1-/-小鼠中尤為明顯，提示TRPV1受體可能通過抑制CCR2而減少單核/巨噬細(xì)胞的浸潤，從而實(shí)現(xiàn)其腎臟保護(hù)作用。

傳統(tǒng)生理學(xué)認(rèn)為，TRPV1受體主要表達(dá)于感覺神經(jīng)纖維，包括C類和Aδ感覺神經(jīng)纖維，該類感覺神經(jīng)纖維廣泛分布于心血管及腎臟系統(tǒng)，并參與對(duì)心血管及腎臟功能的調(diào)節(jié)［6］。近期研究發(fā)現(xiàn)，除感覺神經(jīng)纖維外，TRPV1受體亦廣泛存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞，激活后可通過腺苷酸活化蛋白激酶信號(hào)通路激活內(nèi)皮型一氧化氮合成酶 (endothelial nitric oxide synthase，eNOS)，從而增加一氧化氮產(chǎn)生［12-13］。此外，研究發(fā)現(xiàn)在鹽敏感性高血壓動(dòng)物模型中，激活TRPV1受體可減少氧自由基的產(chǎn)生，其機(jī)制可能與激活eNOS產(chǎn)生一氧化氮有關(guān)［14］。Ali等［15］利用分子生物學(xué)方法證實(shí)，改善eNOS功能可減少活性氧的產(chǎn)生，從而抑制MCP-1/CCR2信號(hào)通路。根據(jù)上述研究結(jié)果，筆者推測(cè)TRPV1受體抑制MCP-1/CCR2信號(hào)通路的機(jī)制可能與調(diào)節(jié)eNOS功能、減少活性氧的產(chǎn)生有關(guān)。本研究結(jié)果也顯示，TRPV1基因敲除小鼠給予DOCA和鹽水后尿中的氧化應(yīng)激產(chǎn)物 (即8-異構(gòu)前列腺素)顯著增加，但是，激活的TRPV1受體抑制MCP-1/CCR2信號(hào)通路的機(jī)制有待進(jìn)一步研究闡明。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)CCR2誘導(dǎo)的以單核/巨噬細(xì)胞浸潤為主的炎癥反應(yīng)在鹽敏感性高血壓造成的腎臟損害中發(fā)揮著重要作用。CCR2阻斷劑通過抑制單核/巨噬細(xì)胞的浸潤及氧化應(yīng)激反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)其在鹽敏感性高血壓過程中的腎臟保護(hù)作用。臨床上通過藥理學(xué)方法阻斷CCR2介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能成為防治鹽敏感性高血壓所致腎臟損害的方法之一。TRPV1可通過抑制CCR2介導(dǎo)的單核/巨噬細(xì)胞浸潤減少鹽敏感性高血壓所誘導(dǎo)的腎臟損害。因此，在臨床上有可能通過調(diào)節(jié)TRPV1受體功能防治高血壓，尤其是鹽敏感性高血壓，所誘發(fā)的終末期腎臟損害。

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