小干擾RNA抑制真核翻譯起始因子5A2對(duì)MKN28胃癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響

孟慶彬，于健春，康維明，馬志強(qiáng)，周 立，葉 欣，曹戰(zhàn)江，田樹(shù)波中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院基本外科，北京00730

2武漢市第一醫(yī)院胃腸外科，武漢430022

胃癌是中國(guó)第2位常見(jiàn)的腫瘤相關(guān)死亡原因［1］，侵襲特性導(dǎo)致胃癌患者預(yù)后較差，闡明胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制對(duì)于胃癌治療具有重要意義。真核翻譯起始因子5A2(eukaryotic translation initiation factor 5A2，EIF5A2)作為可能的癌基因在卵巢癌［2-3］、膀胱癌［4］、肺癌［5］、肝癌［6］、結(jié)直腸癌［7-8］、胰腺癌［9］及黑色素瘤［10］等多種人類(lèi)腫瘤中表達(dá)異常升高并通過(guò)多種途徑誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移及侵襲［11］?；蚪M篩查發(fā)現(xiàn)，EIF5A2在預(yù)測(cè)胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面可能發(fā)揮重要作用［12］，但EIF5A2在胃癌細(xì)胞增殖和遷移侵襲過(guò)程中的作用機(jī)制鮮有報(bào)道。本研究采用小干擾 RNA(small interfering RNA，siRNA)轉(zhuǎn)染MKN28細(xì)胞，評(píng)估了抑制EIF5A2對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響及其可能的分子機(jī)制。

材料和方法

材料及試劑MKN28、HGC27人胃癌細(xì)胞由北京協(xié)和醫(yī)院基本外科實(shí)驗(yàn)室保存。永生化正常胃黏膜上皮細(xì)胞 (immortalized gastric mucosal epithelial cells，GES-1)購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。胃癌及匹配的非癌正常胃黏膜新鮮組織由2例于北京協(xié)和醫(yī)院接受胃癌根治術(shù)的胃中-低分化腺癌患者獲得，并獲得患者知情同意及北京協(xié)和醫(yī)院倫理委員會(huì)授權(quán)。BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒和ECL發(fā)光劑購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒 (cell counting kit-8，CCK-8)購(gòu)自日本Dojindo公司，RPMI-1640及胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，EIF5A2、C-myc兔單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Epitomics公司，E-cadherin、vimentin、Cyclin D1、轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白-1(metastasis-associated protein 1，MTA1)兔單克隆抗體及Cyclin D3鼠單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司，GAPDH兔多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa cruz公司，山羊抗鼠和抗兔抗體購(gòu)自中杉金橋生物技術(shù)有限公司;引物、siRNA、Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑、超純RNA提取試劑盒，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄合成試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)BD公司;PVDF膜購(gòu)自Amersham Biosciences公司。

siRNA的設(shè)計(jì)及合成3對(duì)EIF5A2 siRNA及對(duì)照siRNA均由美國(guó)Invitrogen公司設(shè)計(jì)合成，其序列分別為:(1)siRNA#1:正義鏈 5’-GCUUCCAGCACUUAC CCUATT-3’，反義鏈 5’-UAGGGUAAGUGCUGGAAGCTT-3’;(2)siRNA#2:正義鏈5’-GGUUCACCUUGUUGGAA UUTT-3’，反義鏈 5’-AAUUCCAACAAGGUGAACCTT-3’;(3)siRNA#3正義鏈5’-GGAUCUUAAACUGCCAGAATT-3’，反義鏈 5’-UUCUGGCAGUUUAAGAUCCTT-3’;(4)對(duì)照 siRNA:正義鏈5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’;反義鏈 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。

細(xì)胞培養(yǎng)及siRNA轉(zhuǎn)染用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞 (MKN28、HGC27及GES-1)并接種在培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，置于37℃、5%CO2、95%濕度的孵箱內(nèi)培養(yǎng)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR)法及 Western blot法檢測(cè) EIF5A2表達(dá)水平，選取EIF5A2高表達(dá)細(xì)胞株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染前24 h接種胃癌細(xì)胞于6孔板內(nèi)，每孔接種4×105個(gè)細(xì)胞，24 h后約長(zhǎng)滿(mǎn)60%進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。設(shè)置siRNA#1、siRNA#2、siRNA#3、陰性對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染組以及空白對(duì)照組(H2O代替siRNA)，每孔siRNA與脂質(zhì)體Lipofectamine 2000的比例為100 pmol∶5 μl，轉(zhuǎn)染6 h后更換細(xì)胞培養(yǎng)基;24 h后提取總RNA，48 h后提取總蛋白;轉(zhuǎn)染24 h后進(jìn)行細(xì)胞增殖、遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)。

CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖設(shè)EIF5A2 siRNA轉(zhuǎn)染組和對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染組。轉(zhuǎn)染siRNA至6孔板MKN28細(xì)胞，每組3個(gè)重復(fù)孔;孵育24 h后消化計(jì)數(shù)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104/ml，取100 μl接種于96孔板內(nèi)孵育;分別于貼壁后0、24、48、72 h每孔加入10 μl CCK-8，細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1.5 h;酶標(biāo)儀上用450 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度，計(jì)算實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間吸光度值的差異。

Transwell法檢測(cè)細(xì)胞遷移及侵襲能力細(xì)胞遷移能力檢測(cè):實(shí)驗(yàn)分組如上，每組3個(gè)重復(fù)孔;轉(zhuǎn)染24 h后，消化重懸細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為2.5×105/ml;于Transwell板下室內(nèi)加入500 μl含20%血清完全培養(yǎng)基，上室加入200 μl細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24 h后棄去陳舊培養(yǎng)基，用棉簽輕輕拭去上室內(nèi)未遷移細(xì)胞;甲醇固定，蘇木素伊紅染色;倒置顯微鏡下觀(guān)察，選5個(gè)代表區(qū)域，200倍鏡下計(jì)數(shù)，取均值。細(xì)胞侵襲能力檢測(cè):Matrigel膠預(yù)先包被Transwell板上室基底膜，細(xì)胞鋪板前水化基底膜;細(xì)胞接種濃度5×105/ml，余方法同細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。

qRT-PCR法檢測(cè)RNA干擾對(duì)EIF5A2表達(dá)的影響siRNA轉(zhuǎn)染24 h后收集細(xì)胞，TRIzol法提取細(xì)胞總RNA。反轉(zhuǎn)錄合成EIF5A2 cDNA(EIF5A2引物序列:正義鏈:5’-AACTGCCAGAAGGTGAACTAGG-3’，反義鏈:5’-GTTTCCGTTTATTTGCAGGGT-3’)。采用熒光定量PCR儀進(jìn)行 qRT-PCR，主要程序:95℃10 min;95℃ 15 s，40個(gè)循環(huán);60℃ 1 min。每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)副孔。GAPDH mRNA作為內(nèi)參對(duì)照 (引物序列:正義鏈:5’-TCAACGACCACTTTGTCAAGCTCA-3’，反義鏈:5’-GCTGGTGGTCCAGGGGTCTTACT-3’)。

Western blot法檢測(cè)RNA干擾對(duì)EIF5A2及可能靶蛋白表達(dá)的影響 siRNA轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞提蛋白，BCA法檢測(cè)蛋白濃度。每孔60 μg蛋白上樣，聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉;洗膜，一抗孵育 (兔抗人EIF5A2單抗，兔抗人GAPDH多抗，均1∶1000稀釋)，4℃冰箱中搖床上過(guò)夜;次日洗膜，二抗室溫孵育1 h(HRP標(biāo)記的山羊抗兔或抗鼠二抗，1∶3000稀釋);洗膜，行辣根過(guò)氧化物酶化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)劑顯色反應(yīng)，顯像。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，計(jì)量資料組間比較如滿(mǎn)足方差齊則采用雙側(cè)Studentt檢驗(yàn)，不滿(mǎn)足方差齊性檢驗(yàn)的數(shù)據(jù)比較則采用Satterthwaite近似t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，雙向P值，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

EIF5A2在MKN28、HGC27、GES-1細(xì)胞及人胃癌和非癌正常胃黏膜組織內(nèi)的表達(dá)qRT-PCR法及Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示:EIF5A2 mRNA及蛋白在MKN28胃癌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)水平最高，在GES-1細(xì)胞內(nèi)表達(dá)水平最低;EIF5A2蛋白在2例人胃癌組織的表達(dá)均明顯高于在匹配的非癌正常胃黏膜組織的表達(dá)(圖1)。

3對(duì)EIF5A2 siRNA對(duì)EIF5A2 mRNA及編碼蛋白的抑制效果與空白對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)染24 h后，EIF5A2 siRNA#1(P=2.0×10-4)、siRNA#2轉(zhuǎn)染組(P=0.002)EIF5A2 mRNA表達(dá)水平均明顯下降，其中以siRNA#1轉(zhuǎn)染組下降最明顯，但control siRNA(P=0.570)及EIF5A2 siRNA#3轉(zhuǎn)染組 (P=0.231)EIF5A2 mRNA表達(dá)水平較空白對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染48 h后，siRNA#1、siRNA#2轉(zhuǎn)染組EIF5A2蛋白表達(dá)水平均較對(duì)照組下調(diào)，其中以siRNA#1轉(zhuǎn)染組下降最明顯(圖 2)。

EIF5A2-siRNA#1轉(zhuǎn)染對(duì)MKN28細(xì)胞增殖能力的影響在細(xì)胞接種后0 h，EIF5A2 siRNA#1轉(zhuǎn)染組與control-siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖能力 (A450吸光度值)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P=0.612);在細(xì)胞接種后的24(P=0.003)、48(P＜0.001)、72 h(P＜0.001)，與control-siRNA轉(zhuǎn)染組比較，EIF5A2 siRNA#1轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖能力均明顯減弱 (圖3)。

EIF5A2-siRNA#1轉(zhuǎn)染對(duì)胃癌細(xì)胞MKN28遷移、侵襲能力的影響與control-siRNA轉(zhuǎn)染組比較，EIF5A2-siRNA#1轉(zhuǎn)染后明顯抑制了MKN28遷移能力(P＜0.001)和侵襲能力 (P＜0.001)(圖4)。

圖1 EIF5A2在胃癌細(xì)胞、永生化正常胃黏膜上皮細(xì)胞及人胃癌和非癌胃黏膜組織內(nèi)的表達(dá)Fig 1 Expressions of EIF5A2 in human gastric cancer cell lines and the immortalized gastric mucosal epithelial cell line，gastric adenocarcinoma and the paired distant non-tumor tissues

EIF5A2-siRNA#1對(duì)MKN28細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響與對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染組相比，EIF5A2 siRNA#1轉(zhuǎn)染組EIF5A2、Cyclin D1、Cyclin D3蛋白及MTA1和C-myc蛋白表達(dá)均明顯下調(diào)，同時(shí)EIF5A2 siRNA#1轉(zhuǎn)染組間質(zhì)指標(biāo)Vimentin表達(dá)明顯下調(diào)，E-cadherin表達(dá)呈上調(diào)趨勢(shì);對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染組與EIF5A2 siRNA#1轉(zhuǎn)染組基質(zhì)金屬蛋白酶-9(metallopeptidase-9，MMP-9)表達(dá)水平無(wú)明顯差異 (圖5)。

圖2 siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)EIF5A2 mRNA及蛋白表達(dá)的影響Fig 2 Effects of siRNA transfection on EIF5A2 mRNA and protein expressions

圖3 EIF5A2-siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)MKN28細(xì)胞增殖的影響Fig 3 Effects of EIF5A2-siRNA transfection on proliferation of MKN28 cells

圖4 EIF5A2-siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)MKN28遷移、侵襲能力的影響Fig 4 Effects of EIF5A2-siRNA transfection on the migration and invasion of MKN28 cells

圖5 EIF5A2-siRNA#1轉(zhuǎn)染對(duì)MKN28細(xì)胞內(nèi)EIF5A2可能靶蛋白表達(dá)的影響Fig 5 Effects of EIF5A2-siRNA#1 transfection on the expressions of possible targeting proteins of EIF5A2 in MKN28 cells

討 論

EIF5A2基因定位在人類(lèi)染色體3q26.2區(qū)，其編碼產(chǎn)物作為可能的癌蛋白在多種人類(lèi)腫瘤內(nèi)高表達(dá)，并與其增殖、侵襲轉(zhuǎn)移和/或預(yù)后密切相關(guān)［11］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抑制EIF5A2可明顯抑制MKN28細(xì)胞的增殖能力，提示EIF5A2蛋白可能是促進(jìn)MKN28細(xì)胞增殖的重要分子。有研究顯示，EIF5A2與肝癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞及結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖也密切相關(guān)［2，7，13］，但EIF5A2調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖的分子機(jī)制尚未闡明。Cyclin D1及Cyclin D3在調(diào)控細(xì)胞周期，促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖方面可發(fā)揮重要作用［14-15］。本研究結(jié)果顯示，抑制EIF5A2可明顯下調(diào)MKN28細(xì)胞內(nèi)Cyclin D1和Cyclin D3的表達(dá)水平，提示EIF5A2調(diào)控Cyclin D1和Cyclin D3可能是促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖的機(jī)制之一。

本研究發(fā)現(xiàn)，抑制EIF5A2可明顯降低MKN28胃癌細(xì)胞遷移及侵襲能力。2007年，Marchet等［12］通過(guò)基因組篩查法證實(shí)EIF5A2基因在預(yù)測(cè)胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面可發(fā)揮重要作用。近期研究顯示，EIF5A2-MTA1/C-myc軸在結(jié)直腸癌細(xì)胞EMT及侵襲轉(zhuǎn)移調(diào)控中可能發(fā)揮關(guān)鍵作用［8］。此外有研究證實(shí)，EMT程序和MTA1及C-myc分子與胃癌侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［16-18］。據(jù)此，本研究進(jìn)一步觀(guān)察了 siRNA抑制EIF5A2對(duì)MKN28細(xì)胞內(nèi)MTA1、C-myc及 EMT相關(guān)指標(biāo)Vimentin和E-cadherin表達(dá)的可能影響，結(jié)果證實(shí)抑制EIF5A2可明顯抑制MTA1、C-myc及間質(zhì)指標(biāo)Vimentin并上調(diào)上皮指標(biāo)E-cadherin的表達(dá)水平。

綜上，本研究結(jié)果顯示，siRNA抑制EIF5A2可明顯抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力。EIF5A2上調(diào)CyclinD1和Cyclin D3可能是促進(jìn)MKN28胃癌細(xì)胞增殖的可能機(jī)制之一;EIF5A2上調(diào)C-myc、MTA1以及調(diào)控EMT可能是促進(jìn)MKN28胃癌細(xì)胞遷移及侵襲的重要機(jī)制之一。

［1］Chen W，Zheng R，Zhang S，et al.Report of incidence and mortality in China cancer registries，2009［J］.Chin J Cancer Res，2013，25(1):10-21.

［2］Guan XY，F(xiàn)ung JM，Ma NF，et al.Oncogenic role of eIF-5A2 in the development of ovarian cancer［J］.Cancer Res，2004，64(12):4197-4200.

［3］Yang GF，Xie D，Liu JH，et al.Expression and amplification of eIF-5A2 in human epithelial ovarian tumors and overexpression of EIF-5A2 is a new independent predictor of outcome in patients with ovarian carcinoma［J］.Gynecol Oncol，2009，112(2):314-318.

［4］Luo JH，Hua WF，Rao HL，et al.Overexpression of EIF-5A2 predicts tumor recurrence and progression in pTa/pT1 urothelial carcinoma of the bladder［J］.Cancer Sci，2009，100(5):896-902.

［5］He LR，Zhao HY，Li BK，et al.Overexpression of eIF5A-2 is an adverse prognostic marker of survival in stage I nonsmall cell lung cancer patients ［J］.Int J Cancer，2011，129(1):143-150.

［6］Zhang H，Wei S，Ning S，et al.Evaluation of TGFbeta，XPO4，elF5A2 and ANGPTL4 as biomarkers in HCC ［J］.Exp Ther Med，2013，5(1):119-127.

［7］Xie D，Ma NF，Pan ZZ，et al.Overexpression of EIF-5A2 is associated with metastasis of human colorectal carcinoma［J］.Hum Pathol，2008，39(1):80-86.

［8］Zhu W，Cai MY，Tong ZT，et al.Overexpression of EIF5A2 promotes colorectal carcinoma cell aggressiveness by upregulating MTA1 through C-myc to induce epithelial-mesenchymaltransition［J］.Gut，2012，61(4):562-575.

［9］韋潁昕，陳革，尤磊，等.真核翻譯起始因子5A2在胰腺癌中的表達(dá)及與預(yù)后的相關(guān)性［J］.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，35(6):634-638.

［10］Khosravi S，Wong RP，Ardekani GS，et al.Role of EIF5A2，a downstream target of Akt，in promoting melanoma cell invasion［J］.Br J Cancer，2014，110(2):399-408.

［11］孟慶彬，于健春，馬志強(qiáng).EIF5A2在腫瘤中的作用研究進(jìn)展［J］.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2013，33(1):123-125.

［12］Marchet A，Mocellin S，Belluco C，et al.Gene expression profile of primary gastric cancer:towards the prediction of lymph node status［J］.Ann Surg Oncol，2007，14(3):1058-1064.

［13］Lee NP，Tsang FH，Shek FH，et al.Prognostic significance and therapeutic potential of eukaryotic translation initiation factor 5A(eIF5A)in hepatocellular carcinoma［J］.Int J Cancer，2010，127(4):968-976.

［14］Li X，Hao Z，F(xiàn)an R，et al.CIAPIN1 inhibits gastric cancer cell proliferation and cell cycle progression by downregulating CyclinD1 and upregulating P27 ［J］.Cancer Biol Ther，2007，6(10):1539-1545.

［15］Song YA，Park YL，Kim KY，et al.RON is associated with tumor progression via the inhibition of apoptosis and cell cycle arrest in human gastric cancer［J］.Pathol Int，2012，62(2):127-136.

［16］Ninomiya I，Yonemura Y，Matsumoto H，et al.Expression of c-myc gene product in gastric carcinoma ［J］.Oncology，1991，48(2):149-153.

［17］Toh Y，Oki E，Oda S，et al.Overexpression of the MTA1 gene in gastrointestinal carcinomas:correlation with invasion and metastasis［J］.Int J Cancer，1997，74(4):459-463.

［18］Wang SH，Li X，Zhou LS，et al.microRNA-148a suppresses human gastric cancer cell metastasis by reversing epithelial-to-mesenchymal transition ［J］.Tumour Biol，2013，34(6):3705-3712.