足細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對鈣調(diào)神經(jīng)素表達(dá)的調(diào)控

胡蓉蓉，馬 杰，陶建瓴，文煜冰，趙 翠，張 薇，李 航，李明喜，李雪梅，李學(xué)旺中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院腎內(nèi)科，北京00730

2滄州市人民醫(yī)院腎內(nèi)科，河北滄州061000

糖尿病腎病 (diabetic nephropathy，DN)是我國終末期腎病 (end stage renal disease，ESRD)的第2大原因。DN發(fā)病機制復(fù)雜，至今尚不完全明確。鈣調(diào)神經(jīng)素 (calcineurin，CaN)是一種鈣離子敏感的蛋白磷酸激酶，環(huán)孢素A能通過抑制CaN，調(diào)節(jié)足細(xì)胞骨架蛋白synatopodin的穩(wěn)定性［1］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 (endoplasmic reticulum stress，ERS)是指細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊或錯誤折疊蛋白堆積時引起的細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)。近來研究顯示，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時CaN活性增加［2］。糖尿病患者體內(nèi)游離脂肪酸升高，體外細(xì)胞實驗證明游離脂肪酸，尤其是長鏈飽和游離脂肪酸——棕櫚酸鹽能引起ERS［3］。熊去氧膽酸 (ursodeoxycholic acid，UDCA)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的化學(xué)分子伴侶，體外大鼠肝細(xì)胞及糖尿病模型小鼠實驗都證明UDCA能降低ERS感應(yīng)蛋白雙鏈RNA依賴的蛋白質(zhì)激酶 (double-stranded RNA-dependent protei，PKR)類似的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶 (PKR-like ER kinase，PERK)和肌醇依賴酶1α(inositol-requiring enzyme 1α，IRE-1α)的磷酸化，抑制ERS依賴的JNK凋亡途徑，緩解ERS引起的損傷，故常被用作ERS的阻斷劑。本課題組前期工作發(fā)現(xiàn)早期DN中足細(xì)胞存在ERS，本研究觀察了早期DN時足細(xì)胞ERS對CaN表達(dá)的調(diào)控情況，以期明確ERS狀態(tài)下足細(xì)胞CaN的變化，為尋找以調(diào)節(jié)ERS來阻斷早期DN進展的臨床治療決策提供進一步理論依據(jù)。

材料和方法

實驗動物雄性C57BLKS/JLeprdb/db和C57BLKS/JLeprdb/m小鼠，購于南京大學(xué)模式動物研究所。

足細(xì)胞培養(yǎng)足細(xì)胞在33℃，含10%胚牛血清(BSA)、青霉素/鏈霉素 (Gibco，英國)和干擾素Υ(R＆D，美國)的RPMI-1640培養(yǎng)液中生長，37℃無干擾素Υ培養(yǎng)液中分化。所有實驗細(xì)胞均分化14 d。

棕櫚酸鹽溶液配制BSA溶解于雙蒸水配成5%(質(zhì)量/體積)的溶液并過濾，100mmol/L棕櫚酸鹽(Sigma，美國)在60℃ 0.1mmol/L氫氧化鈉溶液中溶解并過濾，用5%BSA稀釋至5mmol/L。溶液冷卻至室溫，4℃冰箱保存。將5mmol/L棕櫚酸鹽/5%BSA溶液與無血清培養(yǎng)液按不同比例混合，其中1mmol/L棕櫚酸鹽為最大濃度組。棕櫚酸鹽組的對照是1%BSA。

共聚焦顯微鏡顯像4%多聚甲醛固定后，用含1%BSA的磷酸溶液緩沖液 (PBS)封閉足細(xì)胞，1∶25(體積比)稀釋度的兔抗鼠鈣調(diào)神經(jīng)素多克隆抗體(抗CaN)(Cell signaling，美國)孵育，再用FITC結(jié)合羊抗兔多克隆抗體 (北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)孵育后PBS清洗，DAPI標(biāo)記細(xì)胞核后，共聚焦顯微鏡下觀察。

蛋白印跡法冰PBS清洗分化足細(xì)胞后，用RIPA裂解液裂解，100℃變性5min。用12%SDS聚乙烯酰胺凝膠電泳后，將蛋白電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidencefluoride，PVDF)，將膜在抗 CaN和抗GAPDH(Abcam，英國)單抗中孵育，再用二抗雜交，ECL顯影。

實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)定量分析轉(zhuǎn)錄子用TRIzol(Invitrogen，美國)提取足細(xì)胞RNAs，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA作為PCR模板，采用iQ5循環(huán)變溫加熱器 (BioRad，美國)進行實時熒光PCR。試驗中所用的引物設(shè)計如下:(1)Calcineurin:Forward:5’-GATGCTGG TCAATGTTCTC-3’;Reverse:5’-CAGGACACTCTCACTCTC-3’。(2)β-actin:Forward:5’-CTCTC CCTCACGCCATCC-3’;Reverse:5’-CTCTCCCTCACGC CATCC-3’。

統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用方差齊性分析，正態(tài)分布數(shù)據(jù)差異顯著性檢驗采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

早期DN小鼠模型中足細(xì)胞CaN的表達(dá)6、9、12周db/m小鼠的24h尿白蛋白水平分別為 (1.5977±1.8720)、(5.4114±5.2605)、 (1.1231±0.4286)μg，db/db小鼠分別為 (30.7268±7.7615)、(196.0933±79.8682)、(185.4407±111.6092)μg，其中，db/db小鼠的24h尿白蛋白水平均明顯高于同周齡的db/m小鼠(P均＜0.001)，9、12周齡db/db小鼠的24h尿白蛋白水平均明顯高于6周齡db/db小鼠 (P均＜0.01)。

選取6、9、12周齡24h尿白蛋白量分別為31.98、143.91、315.49μg的db/db小鼠和6、9、12周齡24h尿白蛋白量分別為1.52、2.35、0.24μg的db/m小鼠進一步觀察CaN及synaptopodin表達(dá)情況，激光共聚焦顯微鏡下可見小鼠腎組織中CaN蛋白分布與synaptopodin相似，且同周齡db/db小鼠的CaN表達(dá)高于db/m小鼠。CaN在db/db小鼠足細(xì)胞中的表達(dá)隨尿白蛋白量的增加而增強 (圖1)。

體外培養(yǎng)小鼠足細(xì)胞在不同濃度棕櫚酸鹽作用下CaN的表達(dá)將足細(xì)胞在0.25和0.50 mmol/L棕櫚酸鹽培養(yǎng)液中孵育3h后，CaN mRNA相對表達(dá)量分別為1.17±0.20和1.52±0.45，明顯高于BSA培養(yǎng)液的0.96±0.09(P均＜0.05)。

激光共聚焦顯微鏡觀察棕櫚酸鹽和UDCA共同作用下體外足細(xì)胞CaN的表達(dá)以1%BSA為對照組，將分化的足細(xì)胞分別在0.25 mmol/L棕櫚酸鹽、0.25 mmol/L棕櫚酸鹽 +0.01 mmol/L UDCA、0.01 mmol/L UDCA繼續(xù)培養(yǎng)3 h，激光共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，棕櫚酸鹽作用下足細(xì)胞CaN蛋白的表達(dá)增強，棕櫚酸鹽聯(lián)用UDCA作用下的足細(xì)胞CaN表達(dá)減弱 (圖2)。對每個標(biāo)記CaN的免疫熒光標(biāo)本觀察20個完整細(xì)胞，比較足細(xì)胞CaN免疫熒光強度，結(jié)果顯示1%BSA對照組、0.25 mmol/L棕櫚酸鹽組、0.25 mmol/L棕櫚酸鹽+0.01 mmol/L UDCA組和0.01 mmol/L UDCA組的免疫熒光強度分別為(243.44±26.87)、(326.74±41.18)、(249.05±40.96)和 (215.19±25.28)I/μm2，其中，0.25 mmol/L棕櫚酸鹽組明顯高于1%BSA對照組 (P＜0.05)，0.25 mmol/L棕櫚酸鹽+0.01 mmol/L UDCA組明顯低于0.25 mmol/L棕櫚酸鹽組 (P＜0.05)，0.01 mmol/L UDCA組明顯低于1%BSA對照組 (P＜0.05)。

圖1 小鼠腎小球激光共聚焦圖像 (40×10×2.5)Fig 1 Confocal microscopy of mice glomeruli(40×10×2.5)

蛋白印跡法檢測棕櫚酸鹽及UDCA作用下體外足細(xì)胞CaN的表達(dá)蛋白印跡法對不同刺激下足細(xì)胞CaN mRNA表達(dá)的檢測結(jié)果顯示，棕櫚酸鹽作用組CaN的表達(dá)較BSA組升高，而棕櫚酸鹽加UDCA組CaN的表達(dá)較棕櫚酸鹽作用組降低 (圖3)。

圖2 小鼠足細(xì)胞CaN標(biāo)記的激光共聚焦圖像 (40×10×2.5)Fig 2 Confocal microscopy of CaN in immortalized mouse podocytes(40×10×2.5)

圖3 不同刺激物作用下足細(xì)胞CaN表達(dá)的蛋白免疫印跡結(jié)果Fig 3 Western blotting of CaN in podocytes treated with different stimulants

討 論

CaN是一種絲氨酸/蘇氨酸特異的蛋白磷酸酶，由相對分子質(zhì)量為59 000的催化亞單位A(CNA)和19 000的調(diào)節(jié)亞單位B(CNB)組成，CNA具有磷酸酶單位，CNB能結(jié)合鈣離子和CNA，CaN通過CaM感受細(xì)胞內(nèi)Ca2+的濃度調(diào)節(jié)自身活性，發(fā)揮作用。在阿爾茨海默病等神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，蛋白錯誤折疊及堆積引起的ERS是其常見且典型的病理生理特點，而且很可能是致病的啟動因子［4-5］，這些疾病中存在CaN活性的增加［6-7］。2010年，國內(nèi)有報道ERS誘導(dǎo)劑毒胡蘿卜素 (thapsigargin，TG)作用大鼠新生心肌細(xì)胞時，存在心肌細(xì)胞肥大，細(xì)胞內(nèi)Ca2+上升，CaN表達(dá)上調(diào)，加用環(huán)孢素A能抑制心肌肥大［2］。目前尚沒有研究觀察DN時足細(xì)胞中CaN表達(dá)的變化情況。本研究通過對早期DN小鼠模型足細(xì)胞的觀察，發(fā)現(xiàn)早期DN小鼠中存在足細(xì)胞CaN表達(dá)的升高。

Chen等［8］研究發(fā)現(xiàn)，大鼠心肌缺血/再灌注損傷中，網(wǎng)鈣蛋白、CHOP及半胱天冬酶-12等ER分子伴侶表達(dá)升高，且CaN的表達(dá)也升高，缺血/再灌注損傷上調(diào)CaN表達(dá)并強化了ERS引起的損傷。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，隨著尿蛋白量的增加，ERS的標(biāo)志蛋白GRP78在db/db小鼠足細(xì)胞的表達(dá)增強。本研究對同一小鼠模型腎小球CaN表達(dá)進行激光共聚焦顯像觀察發(fā)現(xiàn)，CaN表達(dá)的變化與GRP78一致，并由此推測足細(xì)胞ESR時伴有CaN表達(dá)上調(diào)。

本課題組前期研究及文獻報道發(fā)現(xiàn)足細(xì)胞在棕櫚酸鹽刺激下產(chǎn)生ERS［9］。本研究進一步探究ERS時CaN表達(dá)的變化情況，以棕櫚酸鹽刺激3h的足細(xì)胞為觀察對象，在激光共聚焦顯微鏡下觀察到足細(xì)胞CaN表達(dá)升高;而Real-Time PCR CaN mRNA水平的半定量分析發(fā)現(xiàn)，隨著棕櫚酸鹽刺激濃度的增加，CaN mRNA水平也增加。

2002年Xie等［10］在人體肝臟細(xì)胞系 (Huh 7)中研究發(fā)現(xiàn)，?；切苋パ跄懰?(taurousodeoxycholic acid，TUDCA)具有抑制ER內(nèi)Ca2+外流，激活ERS標(biāo)志蛋白GRP78及凋亡前因子caspase-12的作用，故被作為ER化學(xué)分子伴侶的抑制劑，并用于抑制ERS的比較研究，UDCA和TUDCA降低GRP78的作用程度相似。2006年，Ozcan等［11］在體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，db/db小鼠口服攝入TUDCA能明顯使血糖正?；?，并改善組織對胰島素的反應(yīng)。進一步研究顯示，TUDCA處理小鼠的PERK和IRE-1α磷酸化及JNK的活化被抑制，而同時對胰島素受體信號具有反向調(diào)節(jié)作用的胰島素受體信號-1也被抑制，胰島素受體信號能力有明顯恢復(fù)。此外，在db/db小鼠心肌細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，TUDCA能緩解FFA/ERS引小的心肌收縮功能障礙［12］。故本研究設(shè)計了棕櫚酸鹽聯(lián)合UDCA作用的細(xì)胞組，激光共聚焦和蛋白免疫印跡檢測均發(fā)現(xiàn)在棕櫚酸鹽聯(lián)用UDCA與單用棕櫚酸鹽相比，CaN的表達(dá)減低。結(jié)合UDCA在胰島素抵抗及ERS中的作用，推測在足細(xì)胞中，通過抑制ERS可以減弱CaN的表達(dá)。

Faul等［1］研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)孢素A的抗尿蛋白作用主要是通過直接抑制足細(xì)胞鈣神經(jīng)蛋白介導(dǎo)synaptopodin的去磷酸化，穩(wěn)定細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)、促進足細(xì)胞修復(fù)實現(xiàn)的。在小鼠腎臟冰凍切片激光共聚焦試驗中，應(yīng)用synaptopodin綠色熒光標(biāo)記足細(xì)胞，紅色熒光顯示CaN，激光共聚焦三通道同時攝像觀察，能較客觀地分析功能蛋白的形態(tài)學(xué)分布，比較其表達(dá)變化。本研究觀察發(fā)現(xiàn)，在db/db小鼠腎組織，隨尿蛋白量的增加，CaN的表達(dá)也增強，6周齡db/db小鼠腎小球內(nèi)分布的CaN與同周齡db/m小鼠無明顯差別，但9周齡db/db小鼠的CaN較同周齡db/m小鼠有明顯增加，并且這個信號的增強在12周齡時呈遞增趨勢;而synaptopodin的表達(dá)強度在6周齡db/db小鼠中與正常小鼠相似，9周齡和12周齡db/db小鼠均較正常小鼠減弱，兩者差別不明顯。

與在肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞等得到的結(jié)果類似，本研究在足細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，通過UDCA阻斷ERS時，CaN表達(dá)上調(diào)被抑制，這點提示或許在早期DN的治療中可以使用UDCA，通過緩解ERS而得到阻斷早期DN進展的臨床期望。該點尚需要更多基礎(chǔ)和臨床深入研究以得到明確和證實。

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