MiR-503逆轉(zhuǎn)肺癌耐藥細(xì)胞株A549/DDP的耐藥性及其機(jī)制研究

武毅 郭麗麗 劉京豪 劉仁旺 劉明輝 陳軍

肺癌是世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，每年肺癌造成大約560,000死亡，其中一半來(lái)自中國(guó)[1]。由于起病隱匿，早期少有癥狀或癥狀不明顯，大多數(shù)肺癌患者在確診時(shí)往往已到了晚期。近年來(lái)，由于治療方案的不斷優(yōu)化，以及靶向藥物的投入使用，肺癌的治療現(xiàn)狀已經(jīng)得到了明顯的改善，但仍然存在一些急需解決的問(wèn)題，例如腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的耐受性[2]。順鉑通過(guò)靶向DNA和拓?fù)洚悩?gòu)酶II（Topo II），抑制DNA的合成和轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，最終阻止腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[3]。在臨床運(yùn)用過(guò)程中，肺癌細(xì)胞往往發(fā)展出對(duì)順鉑的耐藥性，使得藥效明顯下降。因此，探討腫瘤細(xì)胞的耐藥機(jī)制，開(kāi)發(fā)新的逆轉(zhuǎn)耐藥性的方法，對(duì)提高臨床患者的受益有十分重要的意義。已有的研究[4-7]發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥的機(jī)制包括減少藥物的吸收，通過(guò)ABC（ATP-binding cassette）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白增加藥物的外排，通過(guò)谷胱甘肽系統(tǒng)增加對(duì)抗腫瘤藥物的解毒作用，凋亡途徑異常減少腫瘤細(xì)胞的凋亡[4-7]。

MiRNAs是一類(lèi)內(nèi)源性的不編碼蛋白的小RNAs，長(zhǎng)度一般為18個(gè)-24個(gè)核苷酸，可通過(guò)與目標(biāo)mRNA的互補(bǔ)序列相結(jié)合，在后轉(zhuǎn)錄水平對(duì)基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，導(dǎo)致目標(biāo)mRNA的降解或者基因沉默[8]。很多研究[9,10]已經(jīng)提供了特異性miRNAs的表達(dá)與腫瘤密切相關(guān)的證據(jù)，這些研究清楚的展現(xiàn)出一個(gè)單獨(dú)的miRNA可通過(guò)其調(diào)控的目標(biāo)基因，對(duì)多種與腫瘤細(xì)胞失控生長(zhǎng)、抗凋亡、遷移和侵襲，甚至是腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物治療的應(yīng)答產(chǎn)生調(diào)控作用。

最近，miRNA-503（miR-503）在癌癥中的作用備受關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)miR-503在口腔癌和肝細(xì)胞癌中的表達(dá)下調(diào)[11,12]，但在甲狀旁腺癌和腎上腺皮質(zhì)癌中卻過(guò)表達(dá)[13,14]。并且，在腎上腺癌中，miR-503上調(diào)與患者的總體生存期縮短有關(guān)[13]。在肝癌細(xì)胞系HCCLM3中，miR-503則可誘導(dǎo)細(xì)胞停滯于G1期并抑制細(xì)胞的遷移和侵襲[11]。然而，miR-503在肺癌耐藥性中的作用尚無(wú)太多的研究。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)miR-503的高表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)A549/DDP的耐藥性，抑制該細(xì)胞的生長(zhǎng)并促進(jìn)其凋亡。我們的結(jié)果說(shuō)明miR-503在肺癌順鉑耐藥中發(fā)揮重要作用，其機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)控多種與耐藥相關(guān)蛋白，細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白和凋亡相關(guān)蛋白等有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和A549/DDP購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco；可穩(wěn)定表達(dá)miR-503的miR-503 precursor質(zhì)粒（pre-miR-503）及其陰性對(duì)照質(zhì)粒購(gòu)自Invitrogen；TaqMan MicroRNA assay kit購(gòu)自Applied Biosystems；Lipofectamine 2000購(gòu)自Gibco；MTS、Rh-123、RT-PCR試劑盒，pGL4.74[hRluc/TK]質(zhì)粒，pGL4.32(luc2P/NF-κBRE/Hygro)質(zhì)粒，pGL 4.44[luc2P/AP1 RE/Hygro]和Dual-GloTM Luciferase assay system均購(gòu)自Promega公司；細(xì)胞凋亡流式檢測(cè)試劑盒購(gòu)自BD biosciences；單克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz公司；ECL免疫印跡底物試劑盒購(gòu)自Millipore；順鉑購(gòu)自Sigma公司；流式細(xì)胞儀：BD公司，酶標(biāo)儀：Thermo，PCR儀：Thermo。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與miR-503轉(zhuǎn)染 A549和A549/DDP細(xì)胞培養(yǎng)于10 cm培養(yǎng)皿，37oC、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)基為90% EMEM，10%胎牛血清。0.25%胰酶-EDTA消化傳代，所有試驗(yàn)均采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。將A549/DDP細(xì)胞暴露于底劑量［1/10的半數(shù)抑制濃度（50%concentration of inhibition, IC50）］的順鉑中維持細(xì)胞耐藥性。

A549/DDP培養(yǎng)于10 cm培養(yǎng)皿中，待其達(dá)到約80%融合時(shí)，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)的操作方法，加入100 nmol/L pre-miR-503質(zhì)?；蛘哧幮詫?duì)照質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。傳代培養(yǎng)后，取細(xì)胞裂解后，用TaqMan MicroRNA assay kit進(jìn)行Q-PCR實(shí)驗(yàn)，定量檢測(cè)miR-503，以評(píng)估premiR-503的轉(zhuǎn)染效果。

1.3 MTS法檢測(cè)miR-503對(duì)細(xì)胞耐藥性的作用 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，以2×104/mL接種到96孔微孔板中，100 μL/孔，培養(yǎng)過(guò)夜使細(xì)胞貼壁。向?qū)?yīng)試驗(yàn)孔加入不同濃度的順鉑，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，吸去培養(yǎng)基，加入100 μL含0.5 mg/mL MTS的RPMI-1640，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。最后用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm波長(zhǎng)下的光密度（optical density, OD）值，并計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞的抑制率。抑制率=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。以順鉑濃度為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)作圖并擬合抑制曲線(xiàn)，求得IC50值。逆轉(zhuǎn)倍數(shù)（reversal fold, RF）= IC50（無(wú)miR-503）/IC50（有miR-503）。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)A549/DDP細(xì)胞內(nèi)Rh-123含量及細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的經(jīng)pre-miR-503質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的A549/DDP細(xì)胞，加入10 μmol/L Rh-123染液，培養(yǎng)1 h后收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至106/mL，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞中Rh-123的熒光強(qiáng)度（488 nm激發(fā)光，560 nm發(fā)射光），以此檢測(cè)細(xì)胞中Rh-123的含量。細(xì)胞凋亡采用PI/Annexin V-FITC雙染法，均根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。以陰性對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞作為對(duì)照。

1.5 Western blot法檢測(cè)A549/DDP細(xì)胞中多種蛋白的表達(dá)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的經(jīng)pre-miR-503轉(zhuǎn)染的A549/DDP細(xì)胞，收集細(xì)胞裂解提取蛋白。BCA法測(cè)定細(xì)胞裂解物的蛋白含量，取等量蛋白質(zhì)以12% SDS-PAGE法分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，以單克隆抗體4oC過(guò)夜孵育以檢測(cè)目標(biāo)蛋白。洗去一抗，以HRP連接的二抗于室溫孵育2 h，洗滌后以ECL試劑盒顯示免疫印跡條帶。α-tubulin作為內(nèi)參。

1.6 Real-time PCR檢測(cè)A549/DDP腫瘤細(xì)胞中多種蛋白基因的mRNA水平 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的經(jīng)pre-miR-503轉(zhuǎn)染的A549/DDP細(xì)胞，用Trizol法提取各組總RNA，用Real-time PCR試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。MDR1上游引物序列：5'-AAAAAGATCAACTCGTACCACTC-3'，下游引物序列：5'-GCACAAAATACACCAACAA-3'；MRP1上游引物序列5′-ACTTCCACATCTGCTTCGTCAGT-3，下游引物序列：5′-ATTCAGCCACAGGAGGTAGAGAGC-3′；ERCC1上游引物序列：5′-GGGAATTTGGCGACGTAATTC-3′，下游引物序列：5′-GCGGAGGCT-GAGGAACAG -3′；RhoE上游引物序列：5′-CCTCCACGTTGATTCGACTGTT-3′，下游引物序列：5′-TGTAAAAGCCG-TACGTTGCGGT-3′；Survivin上游引物序列：5′-GCATGGGTGCCCCGACGTT G-3′，下游引物序列： 5′-GCTCCGGCCAGAGGCCTCAA-3′；Bcl-2上游引物序列：5′-ACGGGGTGAACTG GGGGAGGA-3′，下游引物序列：5′-TGTTTGGGG CAGGCATGTTGACTT-3′；β-actin上游引物序列：5′-TGAGCGCGGCTACAGCTT-3′，下游引物序列：5′-TC CTTAATGTCACGCACGATTT-3′；94oC變性3 min后，按下述條件擴(kuò)增36個(gè)循環(huán)：95oC 15 s，65oC 30 s，72oC 95 s，72oC延伸5 min。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以Mean±SD表示，使用SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析。采用單因素方差分析（One-way ANOVA）進(jìn)行比較，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 成功構(gòu)建miR-503高表達(dá)的A549/DDP 如圖1所示，與對(duì)照組（A549/DDP細(xì)胞中轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒）和未處理的原發(fā)A549/DDP細(xì)胞相比較，pre-miR-503轉(zhuǎn)染的A549/DDP細(xì)胞中，miR-503的表達(dá)水平明顯上升，這一結(jié)果說(shuō)明miR-503高表達(dá)的A549/DDP構(gòu)建成功。

圖 1 MiR-503在人肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)。在A(yíng)549/DDP細(xì)胞中轉(zhuǎn)染premiR-503質(zhì)粒48 h后，利用TaqMan MicroRNA分析試劑盒，通過(guò)Q-PCR檢測(cè)miR-503的表達(dá)水平。未處理組：A549/DDP細(xì)胞；對(duì)照組：轉(zhuǎn)染空白對(duì)照質(zhì)粒的A549/DDP細(xì)胞；miR-503組：轉(zhuǎn)染pre-miR-503質(zhì)粒的A549/DDP細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，n=10，*表示與對(duì)照組相比，P＜0.05。Fig 1 The expression of miR-503 in human lung cancer cell lines. After transfection pre-miR-503 plasmids into A549/DDP cells for 48 h, the expression of miR-503 was detected by Q-PCR using TaqMan MicroRNA assay kit. Untreated group: the primary A549/DDP cells; Control group:A549/DDP cells transfected with control blank vector; miR-503 group:A549/DDP cell transfected with pre-miR-503 plasmids. Data was represented as Mean±SD, n=10, bars indicate SD, *compared to the control group (P＜0.05).

2.2 轉(zhuǎn)染miR-503可逆轉(zhuǎn)A549/DDP的耐藥性，提高胞內(nèi)Rh-123濃度，促進(jìn)細(xì)胞凋亡 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比較，pre-miR-503轉(zhuǎn)染的細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性明顯增加，pre-miR-503組IC50為17.6 μM，其逆轉(zhuǎn)系數(shù)是對(duì)照組（IC50為43.7 μM）的2.48倍；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miR-503轉(zhuǎn)染組細(xì)胞吸收熒光染料Rh-123的能力較對(duì)照組提高了2.49倍，細(xì)胞凋亡率是對(duì)照組的10.3倍 (圖2)。而且這些變化均與miR-503轉(zhuǎn)染構(gòu)成量效關(guān)系。

圖 2 A549/DDP細(xì)胞中miR-503對(duì)藥物敏感性，Rh-123的胞內(nèi)濃度及細(xì)胞凋亡的作用。A：MTS法結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染pre-miR-503后，細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性明顯增加，數(shù)據(jù)以Mean±SD表示，n=10，*表示與對(duì)照組相比，P＜0.05；B：流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染pre-miR-503后，細(xì)胞內(nèi)Rh-123的濃度增加，數(shù)據(jù)以Mean±SD表示，n=10，*表示與對(duì)照組相比，P＜0.05；C：流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染pre-miR-503后，細(xì)胞凋亡數(shù)目增加，數(shù)據(jù)以Mean±SD表示，n=10，*表示與對(duì)照組相比，P＜0.05。Fig 2 The effect of miR-503 on drug sensitivity, intracellular level of Rh-123 and apoptosis in A549/DDP cells. A: The MTS assay indicated that the DDP-sensitivity in pre-miR-503 group was significantly increased while compared to the control group. Data was represented as Mean±SD, n=10,bars indicate SD, *compared to the control group (P＜0.05); B: The flow cytometry assay results showed that there was an increased intracellular level of Rh-123 in pre-miR-503 group compared with control group. Data was represented as Mean±SD, n=10, bars indicate SD, *compared to the control group (P＜0.05); C: The flow cytometry assay results showed that there was an increased apoptosis in pre-miR-503 group compared with control group. Data was represented as Mean±SD, n=10, bars indicate SD, *compared to the control group (P＜0.05).

2.3 MiR-503下調(diào)MDR1、MRP1、ERCC1、Survivin和Bcl-2的表達(dá)，上調(diào)RhoE的表達(dá) 為了進(jìn)一步探討miR-503逆轉(zhuǎn)A549/DDP耐藥性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的可能分子機(jī)制，我們分析了多種與耐藥相關(guān)基因的表達(dá)變化情況。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比較，premiR-503轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中MDR1和MRP1這兩個(gè)多藥耐藥基因和與DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因ERCC1的蛋白的表達(dá)水平均明顯下調(diào)。此外，與腫瘤凋亡抑制相關(guān)的Survivin和Bcl-2的蛋白表達(dá)亦同時(shí)明顯下調(diào)。有趣的是，miR-503上調(diào)了RhoE蛋白的表達(dá)水平（圖3）。進(jìn)一步應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)顯示，在pre-miR-503轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中，MDR1、MRP1、ERCCI、Survivin和Bcl-2等基因的mRNA表達(dá)水平明顯下調(diào)，僅分別是對(duì)照組的18.5%、22.3%、18.6%、42.8%和68.1%（P＜0.05），而RhoE mRNA表達(dá)則是對(duì)照組的206.5%，明顯升高（P＜0.05）。這些結(jié)果表明miR-503對(duì)上述基因表達(dá)的調(diào)控是通過(guò)轉(zhuǎn)錄水平實(shí)現(xiàn)的。

2.4 MiR-503抑制Akt的磷酸化 為了研究miR-503逆轉(zhuǎn)A549/DDP耐藥性的分子機(jī)制，我們重點(diǎn)研究了PI3K/Ak通路。Western blot顯示，pre-miR-503轉(zhuǎn)染后，Akt的磷酸化水平下降，說(shuō)明PI3K/Akt信號(hào)通路受抑制（圖4）。

3 討論

腫瘤細(xì)胞增加藥物的外排，減少藥物的吸收是其耐受化療藥物的一種主要手段。ABC家族的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，例如MDR1和MRP1，可將藥物從細(xì)胞內(nèi)測(cè)泵到外側(cè)，在耐藥的腫瘤細(xì)胞中經(jīng)常過(guò)表達(dá)[15]。Pre-miR-503轉(zhuǎn)染后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)Rhodamin-123的含量升高，間接說(shuō)明miR-503逆轉(zhuǎn)A549/DDP的耐藥性與減少藥物的外排有關(guān)。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，miR-503下調(diào)了MDR1和MRP1蛋白水平與mRNA水平的表達(dá)，為上述假設(shè)提供了佐證。

圖 3 A549/DDP細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pre-miR-503后，耐藥相關(guān)基因的蛋白表達(dá)水平。Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，MDR1、MRP1、ERCC1、Survivin和Bcl-2的蛋白水平明顯降低，而RhoE的蛋白水平明顯增加，α-tubulin為內(nèi)參。Fig 3 The expression of different drug-resistance related genes in A549/DDP cells transfected with pre-miR-503. Compared to the control group, the expression of MDR1,MRP1, ERCC1, Survivin and Bcl-2 were dramatically down-regulated while the expression of RhoE was significantly up-regulated in pre-miR-503 group by western blot assay. α-tubulin was used as an internal control.

圖 4 MiR-503對(duì)Akt磷酸化水平的影響。Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染pre-miR-503質(zhì)粒后，Akt磷酸化水平降低，α-tubulin為內(nèi)參。Fig 4 The effect of miR-503 on phosphorylation of Akt in human lung cancer cell lines.Western blot assay showed that the phosphorylation of Akt was downregulated in premiR-503 group compared with control group. α-tubulin was used as an internal control.

除了MDR1和MRP1，其他分子也可能參與腫瘤細(xì)胞耐受順鉑有關(guān)。ERCC1可以修復(fù)化療藥物造成的DNA損壞[16-18]，因此它的表達(dá)水平很可能與A549/DDP的耐藥性有關(guān)。Western blot顯示，A549/DDP細(xì)胞中ERCC1具有較高的表達(dá)，而pre-miR-503處理后其表達(dá)水平明顯下降，并且這種下降與mRNA的下調(diào)有關(guān)。RhoE是一個(gè)非典型的RhoGTPase家族成員，它一直處于活化的GTP結(jié)合狀態(tài)，最近發(fā)現(xiàn)其在一些主要的肺癌細(xì)胞系和癌組織中的表達(dá)下調(diào)，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[19]。在本研究中，miR-503可上調(diào)RhoE的表達(dá)水平，可能對(duì)腫瘤起到抑制的作用。

Survivin是凋亡抑制蛋白家族的成員，具有腫瘤特異性，只表達(dá)于腫瘤和胚胎組織中，它可抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)增殖和血管新生，因此被認(rèn)為是一個(gè)具有很高價(jià)值的腫瘤治療靶點(diǎn)[20,21]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-503可下調(diào)Survivin表達(dá)，這與miR-503增加腫瘤細(xì)胞的凋亡率相匹配。Bcl-2是一個(gè)在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用的蛋白，可抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，在很多腫瘤中發(fā)現(xiàn)Bcl-2的高表達(dá)與腫瘤的耐藥密切相關(guān)[22,23]。已有研究[24]顯示，在非小細(xì)胞耐順鉑細(xì)胞系A(chǔ)549/CDDP中，miR-503可以下調(diào)Bcl-2的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)腫瘤的耐藥性。本研究發(fā)現(xiàn)，在A(yíng)549/DDP細(xì)胞中，Bcl-2的蛋白表達(dá)水平明顯升高，說(shuō)明Bcl-2介導(dǎo)的抗凋亡是腫瘤產(chǎn)生耐藥的主要機(jī)制之一。而premiR-503轉(zhuǎn)染可使A549/DDP細(xì)胞Bcl-2的表達(dá)明顯下降，這與流式觀(guān)察到的細(xì)胞凋亡率上升一致，是miR-503逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥性的重要機(jī)制之一。

本研究發(fā)現(xiàn)，miR-503對(duì)細(xì)胞耐藥性逆轉(zhuǎn)起著重要調(diào)節(jié)作用的信號(hào)通路是PI3K/Akt[25-27]，miR-503可抑制Akt的磷酸化，抑制PI3K/Akt信號(hào)通路的活性，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，逆轉(zhuǎn)其抗藥性，雖然具體的機(jī)制有待進(jìn)一步的研究，但這種負(fù)調(diào)控可能是miR-503逆轉(zhuǎn)A549/DDP耐藥性的手段之一。