Nrf2在EGFR基因突變肺腺癌中的表達(dá)及其與EGFR-TKIs療效間的相關(guān)性研究

朱翔 梁莉 柳晨 尹文琤 陳森 曹寶山

肺癌目前是世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤[1]，其中80%為非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC），約75%的NSCLC就診時(shí)已屬于中晚期[2]。近年來(lái)，多項(xiàng)臨床研究表明針對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）基因突變的EGFR酪氨酸激酶抑制劑（EGFR tyrosine kinase inhibitors, EGFR-TKIs）可延長(zhǎng)含有EGFR基因突變患者的無(wú)疾病進(jìn)展時(shí)間（progression free survival, PFS）[3-7]，并因其低毒、使用方便越來(lái)越為患者所接受。EGFR-TKIs已成為含有EGFR基因敏感突變患者一線治療的首選。EGFR突變率在肺腺癌中尤為明顯。然而，EGFR-TKIs療效存在個(gè)體差異，因此，探索EGFR突變患者中與EGFR-TKIs療效相關(guān)的分子生物指標(biāo)，對(duì)提高藥物療效、提高患者生活質(zhì)量、減輕患者經(jīng)濟(jì)和心理壓力顯得尤為重要。

Nrf2是細(xì)胞調(diào)節(jié)抗氧化應(yīng)激和親電性應(yīng)激反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子。Nrf2可激活抗氧化反應(yīng)元件（antioxident response element, ARE）調(diào)控的相關(guān)耐藥基因[8]：①細(xì)胞內(nèi)氧化還原基因，如谷氨酸半胱氨酸連接酶、血紅素氧合酶-1等；②II相解毒基因，如谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶、NAD（P）H苯醌氧化還原酶-1（NQO1）等；③編碼轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因，如多藥耐藥蛋白等[8,9]。Nrf2與化療藥物耐藥密切相關(guān)[8,10]。近期Yamadori等[11]發(fā)現(xiàn)，在含有EGFR基因敏感突變的細(xì)胞株中，Nrf2激活可明顯降低EGFR-TKIs療效。但目前尚缺乏Nrf2表達(dá)水平與EGFR-TKIs療效間的相關(guān)臨床研究。本研究擬通過(guò)免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)Nrf2表達(dá)水平，明確Nrf2表達(dá)水平及其與一線EGFR-TKIs療效及患者預(yù)后之間的相關(guān)性。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2007年1月-2012年5月在北京大學(xué)第三醫(yī)院接受EGFR-TKIs一線治療的肺腺癌患者。入組標(biāo)準(zhǔn)：按2004年WHO肺癌分類標(biāo)準(zhǔn)病理診斷為肺腺癌者（本研究由于入組患者部分在2011年前入組且病例數(shù)較少，未采用2011年肺腺癌國(guó)際分類新標(biāo)準(zhǔn)對(duì)腺癌進(jìn)行亞型分類）；含有EGFR基因敏感突變；不能手術(shù)切除的IIIb期和IV期患者（依據(jù)國(guó)際肺癌研究協(xié)會(huì)頒布的第7版分期標(biāo)準(zhǔn)[12]）；所有標(biāo)本為CT引導(dǎo)下肺臟穿刺組織，有足夠的組織標(biāo)本可供免疫組化檢測(cè)；一線治療為EGFR-TKIs；預(yù)計(jì)生存期超過(guò)3個(gè)月；治療前、治療1個(gè)月、后每2個(gè)-3個(gè)月均有影像學(xué)檢查（胸腹部CT、頭顱MRI）?；颊咧委熐昂炇鹬橥鈺?shū)；所用標(biāo)本經(jīng)過(guò)北京大學(xué)第三醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。共納入符合條件的病例31例，包括男性10例，女性21例；年齡范圍24歲-80歲，中位年齡64歲；IIIb期患者7例，IV期患者24例；EGFR外顯子19缺失（E19del）突變患者21例，外顯子21 L858R（E21L858R）突變10例（31例EGFR基因突變檢測(cè)均為測(cè)序法）；接受吉非替尼治療26例，厄洛替尼3例，?？颂婺?例。

1.2 隨訪及后續(xù)治療 所有患者通過(guò)定期來(lái)院或電話隨訪，隨訪開(kāi)始時(shí)間為2007年1月，末次隨訪時(shí)間為2013年6月1日，最短隨訪時(shí)間3個(gè)月，最長(zhǎng)60個(gè)月。31例患者中后續(xù)接受化療者13例，因腦轉(zhuǎn)移或脊柱轉(zhuǎn)移接受放射治療者4例。

1.3 臨床資料收集及療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 記錄患者臨床特征、EGFR TKIs用藥記錄和影像學(xué)指標(biāo)。療效指標(biāo)包括近期和遠(yuǎn)期療效。近期療效按照實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)1.1版[13]分為完全緩解（complete response, CR）、部分緩解（partial response, PR）、疾病穩(wěn)定（stable disease, SD）和疾病進(jìn)展（progressive disease, PD），獲得CR或PR的患者4周或以后確認(rèn)。遠(yuǎn)期療效為PFS和總生存期（overall survival, OS）。PFS定義為從治療開(kāi)始至疾病進(jìn)展或任何原因?qū)е滤劳龅臅r(shí)間，OS定義為從初次治療開(kāi)始至死亡或隨訪終點(diǎn)時(shí)間。1.4 免疫組化檢測(cè)Nrf2表達(dá)

1.4.1 實(shí)驗(yàn)方法 活檢組織標(biāo)本經(jīng)10%甲醛固定后，常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚度切片，。免疫組化采用SP法（兔抗人Nrf2抗體ab31163）購(gòu)于Abacm公司，免疫組化二抗SP檢測(cè)試劑盒購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，Nrf2抗體按1:100稀釋），應(yīng)用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.4.2 結(jié)果判定 采用單盲法閱片（病理醫(yī)師不清楚臨床資料），Nrf2抗原陽(yáng)性反應(yīng)可位于細(xì)胞漿和細(xì)胞核中。隨機(jī)選取5個(gè)中倍鏡視野（200倍），每個(gè)視野記數(shù)200個(gè)腫瘤細(xì)胞。共計(jì)數(shù)1,000個(gè)細(xì)胞。按染色強(qiáng)度分為：0分：無(wú)染色；1分：染色呈淡黃色；2分：染色呈棕黃色；3分：染色呈棕褐色；按核陽(yáng)性細(xì)胞比例（核染色為1分-3分細(xì)胞數(shù)/計(jì)數(shù)細(xì)胞*100%）分為0-100%。本研究中，參照Solis等[14]研究的免疫組化評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，將細(xì)胞核染色強(qiáng)度和細(xì)胞核陽(yáng)性比例乘積＞0定義為Nrf2陽(yáng)性，反之為陰性。此外將核Nrf2染色強(qiáng)度0分和1分者定義為核Nrf2低表達(dá)、2分和3分為核高表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。率的比較采用卡方檢驗(yàn)，或Fisher精確檢驗(yàn)，相關(guān)性檢驗(yàn)采用Pearson檢驗(yàn)，Kaplan-Meier方法進(jìn)行生存分析，Log-rank檢驗(yàn)差異性，多因素分析采用Cox多因素分析模型。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 隨訪及療效 隨訪率為100%。中位隨訪時(shí)間15個(gè)月，隨訪范圍3個(gè)月至-60個(gè)月。無(wú)CR患者，19例（61.3%）PR，7例（22.6%）SD，5例（16.1%）PD。遠(yuǎn)期療效：PFS為1個(gè)月-50個(gè)月，中位PFS 6個(gè)月； OS為3個(gè)月-60個(gè)月，中位OS 15個(gè)月。

2.2 Nrf2蛋白檢測(cè)結(jié)果及其與臨床特征間的關(guān)系 Nrf2在細(xì)胞核和細(xì)胞漿中均可以表達(dá)（圖1A-圖1D），存在個(gè)體差異。Nrf2核陽(yáng)性（核染色強(qiáng)度和細(xì)胞核陽(yáng)性細(xì)胞比例乘積＞0）率為77.4%（24/31），Nrf2陽(yáng)性水平在性別、年齡、吸煙、分化程度、分期、EGFR基因突變狀態(tài)以及客觀緩解組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），見(jiàn)表1。Nrf2核高表達(dá)（細(xì)胞核強(qiáng)度＞1分者）率為38.7% （12/31），PR患者中核Nrf2高表達(dá)率為0（0/19），明顯低于SD和PD患者中的100.0%（7/7和5/5）（P＜0.001），但核Nrf2表達(dá)水平在性別、年齡、吸煙、分化程度、分期、EGFR基因突變狀態(tài)組間無(wú)明顯差異（P＞0.05）（表2）。

表 1 Nrf2陽(yáng)性率同肺腺癌患者臨床特征間的關(guān)系Tab 1 The relationship between positive Nrf2 and clinical features of lung adenocarcinoma patients

2.3 Nrf2表達(dá)水平與EGFR-TKIs緩解程度、PFS、OS相關(guān)性分析 Nrf2陽(yáng)性水平與EGFR-TKIs緩解程度（r=0.290, P=0.113）無(wú)關(guān)，但與PFS（r=-0.590, P＜0.001）和OS（r=-0.694, P＜0.001）相關(guān)，Nrf2陽(yáng)性者的PFS及OS低于Nrf2陰性者。Nrf2核高表達(dá)水平與EGFR-TKI緩解程度（r=-0.914, P＜0.001）和PFS（r=-0.485, P=0.006）相關(guān)，但與OS（r=-0.227, P=0.219）無(wú)關(guān)。Nrf2核高表達(dá)者的緩解程度和PFS低于Nrf2核低或不表達(dá)者。

2.4 生存分析 Kaplan-Meier生存分析表明：①Nrf2陽(yáng)性組PFS和OS低于陰性組。其中位PFS分別為6個(gè)月和12個(gè)月（P=0.057）（圖2A）；中位OS分別為15個(gè)月和54個(gè)月（P=0.013）（圖2B）。②核內(nèi)Nrf2高表達(dá)組PFS明顯低于低或不表達(dá)組，二者OS無(wú)明顯差異。其中位PFS分別4個(gè)月和10個(gè)月（P＜0.001）（圖2C）；中位OS分別為12個(gè)月和30個(gè)月（P=0.331）（圖2D）。③患者PFS和OS與EGFR突變狀態(tài)無(wú)關(guān)。EGFR E19Del突變和E21 L858R突變的中位PFS分別9個(gè)月和5個(gè)月（P=0.890）（圖2E）；中位OS分別為17個(gè)月和15個(gè)月（P=0.848）（圖2F）。

2.5 Cox多因素回歸分析 在校對(duì)患者EGFR基因突變狀態(tài)、分期、Nrf2核內(nèi)表達(dá)、Nrf2陽(yáng)性等因素后，多因素分析表明核Nrf2表達(dá)水平是EGFR-TKIs PFS的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素（P=0.002）；Nrf2陽(yáng)性水平是OS的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素（P=0.042），見(jiàn)表3。

3 討論

EGFR基因敏感突變的肺癌患者一線首選EGFR-TKIs已成為治療共識(shí)。EGFR基因突變集中在EGFR基因的18-21外顯子，其中E19Del和E21 L858R占90%以上，二者也是EGFR TKIs最常見(jiàn)的敏感突變[15,16]。但仍有20%-40%的患者服藥無(wú)效[4-7]，且有效患者獲益程度個(gè)體差異明顯，不論是應(yīng)用第一代TKIs中的吉非替尼、厄洛替尼、?？颂婺?，還是第二代的阿法替尼都存在這種情況。因此，尋找預(yù)測(cè)EGFR-TKIs療效的指標(biāo)成為了研究熱點(diǎn)。雖然針對(duì)EGFR突變本身、EGFR通路相關(guān)分子以及其他通路分子的研究已部分證實(shí)和EGFR TKIs耐藥有關(guān)，如T790M突變、EGFR基因突變豐度、PTEN、PI3K以及c-MET基因擴(kuò)增等[16-19]，但尚不足解釋EGFR-TKIs在EGFR基因突變患者中的療效差異。

表 2 核Nrf2高表達(dá)率同肺腺癌患者臨床特征間的關(guān)系Tab 2 The relationship between high expression of Nrf2 in nucleus and clinical features of lung adenocarcinoma patients

Nrf2是調(diào)控細(xì)胞應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激和親電性應(yīng)激反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子。Nrf2通過(guò)調(diào)控ARE驅(qū)動(dòng)的藥物代謝酶和抗氧化酶/蛋白的表達(dá)，來(lái)保護(hù)細(xì)胞免受或減少外來(lái)有毒物質(zhì)的殺傷[9]。Nrf2的這種保護(hù)作用與腫瘤耐藥密切相關(guān)。多項(xiàng)研究表明Nrf2過(guò)表達(dá)與肺癌細(xì)胞耐藥有關(guān)。但缺乏與EGFR-TKIs療效相關(guān)的臨床研究。

本研究通過(guò)免疫組化方法檢測(cè)31例含有EGFR基因敏感突變的肺腺癌患者，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Nrf2陽(yáng)性率達(dá)77.4%，遠(yuǎn)高于Solis等[14]報(bào)道的陽(yáng)性率26.0%，且也高于曹寶山等[20]前期研究中的報(bào)道34.0%。產(chǎn)生差異的原因在于：①前期小樣本研究發(fā)現(xiàn)晚期患者Nrf2陽(yáng)性表達(dá)遠(yuǎn)高于早期患者[20]，而Solis等[14]研究以早期患者為主，晚期患者不足1/4，或許是產(chǎn)生差異原因之一；②Yamadori等[11]研究發(fā)現(xiàn)EGFR信號(hào)活化可上調(diào)Nrf2表達(dá)水平，因此在EGFR敏感基因突變患者中，EGFR通路活化是導(dǎo)致Nrf2陽(yáng)性表達(dá)率增高原因之一。但是在Solis等[14]報(bào)道的23例EGFR基因突變患者中無(wú)Nrf2陽(yáng)性表達(dá)，此種差異或許與腫瘤分期、種族等因素有關(guān)；③本研究為回顧性研究，樣本量較小，選擇偏倚不能除外。因此，可進(jìn)行前瞻性大樣本研究證實(shí)。本研究中未觀察到Nrf2表達(dá)水平與吸煙、性別有關(guān)，與Solis等[14]報(bào)道不同，或許與EGFR通路激活，抵消了吸煙等刺激導(dǎo)致的區(qū)別以及本研究入組病例數(shù)偏少有關(guān)。

表 3 多因素分析EGFR-TKIs特異性生存的預(yù)后因素 (n=31)Tab 3 Cox regression analysis of the disease-specific survival with EGFR-TKIs (n=31)

圖 2 Kaplan-Meier累計(jì)生存時(shí)間曲線分析。A：Nrf2陽(yáng)性組和陰性組患者的PFS； B：Nrf2陽(yáng)性組和陰性組患者的OS；C：Nrf2核高表達(dá)組和低或不表達(dá)組患者的PFS；D：Nrf2核高表達(dá)組和低或不表達(dá)組患者的OS；E：E19del突變和E21L858R突變組患者的PFS；F：E19del突變和E21L858R突變組患者的OS。Fig 2 Kaplan-Meier cumulative survival time curves analysis. A： PFS between Nrf2 positive expression and negative expression in groups of patients with lung adenocarcinoma； B： OS between Nrf2 positive expression and negative expression in groups of patients with lung adenocarcinoma； C： PFS between Nrf2 nuclear high expression and negative/low expression in groups of patients with lung adenocarcinoma； D： OS between Nrf2 nuclear high expression and negative/low expression in groups of patients with lung adenocarcinoma； E： PFS between E19del and E21L858R in groups of patients with lung adenocarcinoma patients； F： OS between E19del and E21L858R in groups of patients with lung adenocarcinoma patients.

本研究發(fā)現(xiàn)核Nrf2高表達(dá)與EGFR TKIs緩解程度相關(guān)，高表達(dá)組中無(wú)1例患者獲得PR。這與Yamadori等[11]在含有EGFR基因敏感突變的細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn)的現(xiàn)象一致，即Nrf2激活可明顯降低EGFR-TKIs療效[11]。且Nrf2在細(xì)胞核內(nèi)高表達(dá)對(duì)EGFR-TKIs緩解程度的預(yù)測(cè)能力明顯高于Nrf2陽(yáng)性（細(xì)胞核染色強(qiáng)度和細(xì)胞陽(yáng)性比例的乘積）的能力。這或許是因?yàn)椋篘rf2正常情況在胞漿中表達(dá)，一旦進(jìn)入細(xì)胞核中，其可激活A(yù)RE調(diào)控的藥物解毒酶和代謝酶，并促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡[8,9]。本研究生存分析表明：核Nrf2表達(dá)水平、Nrf2陽(yáng)性水平與患者的PFS均相關(guān)，且Nrf2陽(yáng)性水平與患者生存期呈負(fù)相關(guān)。這與Solis[14]和Yang等[21]研究結(jié)果相一致。提示Nrf2表達(dá)既可能是EGFR-TKIs療效的預(yù)測(cè)指標(biāo)，也是預(yù)后的預(yù)測(cè)指標(biāo)。但在本研究中，發(fā)現(xiàn)EGFR不同突變位點(diǎn)患者中其PFS和OS無(wú)差異，這與Jackman等[22]研究結(jié)果不同，其發(fā)現(xiàn)外顯子19缺失突變患者生存期優(yōu)于外顯子21突變。這或許與本研究樣本量小有關(guān)。

目前已經(jīng)清楚，Nrf2可通過(guò)外來(lái)刺激、Nrf2突變、Keap1突變或Keap1甲基化獲得激活[10,23,24]。具體何種機(jī)制在本研究患者群中發(fā)揮作用有待深入研究。

本研究的主要限制在于樣本量偏小，存在選擇偏倚可能。但本研究發(fā)現(xiàn)Nrf2表達(dá)水平與EGFR-TKI近期和遠(yuǎn)期療效相關(guān)，Nrf2核表達(dá)水平是PFS的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，Nrf2陽(yáng)性水平是OS的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，因此Nrf2在含有EGFR突變患者中，可能成為預(yù)測(cè)EGFR-TKIs療效的的理想指標(biāo)。我們將進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行前瞻性研究，以驗(yàn)證Nrf2對(duì)預(yù)測(cè)EGFR-TKI療效和預(yù)后的臨床價(jià)值。