腺病毒介導(dǎo)的ING4基因?qū)θ朔蜗侔┞闶笠浦擦龅纳L抑制作用及其分子機制

黃錦宏 楊吉成 凌春華 趙大國 謝宇鋒 由振華

生長抑制因子4 （inhibitor of growth 4, ING4）基因?qū)偕L抑制因子（ING）家族成員，最初在人腦垂體中被分離出來[1]。該基因定位于染色體12p13-31區(qū)域內(nèi)，由8個外顯子和7個內(nèi)含子組成，cDNA全長1,380 bp，編碼蛋白含249個氨基酸分子[2]。生物信息學(xué)分析顯示ING4有一個PHD（plant homeodomain）鋅指區(qū)和核定位信號（NLS）區(qū)。ING4基因在多種腫瘤中易發(fā)生缺失突變和/或表達下調(diào)，并與腫瘤發(fā)生和腫瘤惡性程度密切相關(guān)[3,4]。外源性ING4基因可通過多種途徑發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)，對多種腫瘤細胞具有抑癌作用，其抑癌作用與抑制腫瘤細胞生長和腫瘤血管的生成，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，調(diào)節(jié)腫瘤細胞生長周期、引起G2/M期阻滯，增強p53活性等有關(guān)[5-8]；為研究ING4在肺癌基因治療中的應(yīng)用，本研究建立SPC-A1細胞肺腺癌裸鼠移植瘤模型，通過腺病毒介導(dǎo)的ING4（Ad-ING4）基因治療，觀察ING4對移植瘤的生長抑制作用，并對其可能的分子機制進行了研究，為肺癌的基因治療提供實驗室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 人肺腺癌細胞株SPC-A1細胞、攜帶綠色熒光蛋白（GFP）的腺病毒（adenovirus Ad-GFP）和腺病毒介導(dǎo)的ING4（Ad-ING4）均由蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)系細胞與分子生物學(xué)教研室提供；培養(yǎng)基RPMI-1640，胎牛血清購自Gibcol Brl公司；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒購自北京碧云天生物技術(shù)研究所；天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）、環(huán)氧化酶-2（COX-2）、Fas、FasL一抗、二抗均購自福州邁新生物技術(shù)公司（進口分裝）。

1.1.2 實驗動物 3周-4周齡，體重約20 g，雄性BALB/cnu/nu裸鼠15只，購自中科院上海斯萊克實驗動物中心［許可證號：SCXK(滬)2007-0005］，飼養(yǎng)于蘇州大學(xué)實驗動物中心SPF級動物室，自由攝入經(jīng)過嚴格滅菌處理的飼料及水，實驗操作遵守?zé)o菌原則。

1.2 方法

1.2.1 細胞的培養(yǎng) SPC-A1細胞用RPMI-1640完全培養(yǎng)基（10%FCS），在37oC、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，2天-3天傳代一次，取對數(shù)生長期的細胞進行造模。

1.2.2 肺腺癌裸鼠移植瘤模型的建立 取對數(shù)生長期的SPC-A1肺腺癌細胞，用PBS調(diào)整細胞濃度制備3.0×107/mL的細胞懸液，于裸鼠右前腋皮下接種細胞懸液100 μL，隔日觀察并記錄肺癌細胞在裸鼠體內(nèi)的生長和成瘤情況。

1.2.3 Ad-ING4對裸鼠移植瘤生長的影響 按常規(guī)法[9]進行，即接種2周左右且腫瘤體積約為0.15 cm3時，應(yīng)用抽簽法將15只裸鼠隨機均分為3組，即：①PBS組：給50 μL PBS/只；②Ad-GFP組：給Ad-GFP 50 μL（1.5×109pfu/mL）/只；③Ad-ING4組：給Ad-ING4 50 μL（1.5×109pfu/mL）/只；各組均采用瘤體內(nèi)注射干預(yù)用藥，隔日1次，共注射6次。第1次治療前及開始治療后隔日測量各組瘤體的瘤長徑（L）和短徑（S），根據(jù)公式V（cm3）=L ×S2×0.5（V：瘤體積，L：長徑，S：短徑），繪制瘤體體積-時間變化曲線；治療15 d后，將裸鼠脫頸處死，取瘤體組織稱重，計算抑瘤率：抑瘤率（%）=（1-實驗組平均瘤重/對照組平均瘤重）×100%。

1.2.4 腫瘤組織病理學(xué)檢查及凋亡指數(shù)測定 將腫瘤組織用10%中性甲醛固定過夜，常規(guī)石蠟包埋，切片，常規(guī)HE染色，用以觀察各組腫瘤組織細胞的形態(tài)變化，初步判斷SPC-A1肺腺癌細胞的凋亡情況。用脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）檢測細胞凋亡，具體操作按試劑盒說明書進行。細胞核呈棕褐色或棕黃色顆粒且具備凋亡細胞形態(tài)學(xué)特征判定為凋亡細胞。每張切片在高倍視野下（×400）取5個視野，分別計數(shù)凋亡細胞數(shù)和細胞總數(shù)，計算凋亡指數(shù)：凋亡指數(shù)（apoptotic index, AI）=凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。

1.2.5 免疫組織化學(xué)SP法檢測凋亡相關(guān)因子的表達 取上述各組瘤體組織，用免疫組織化學(xué)SP法染色，檢測Caspase-3、COX-2、Fas與FasL凋亡相關(guān)因子的表達。以高倍鏡（×400）下10個視野的陽性細胞數(shù)，取平均值（陽性細胞為細胞質(zhì)內(nèi)呈彌漫狀分布的棕黃色顆粒）作為各凋亡相關(guān)因子的表達強度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。實驗數(shù)據(jù)用Mean±SD表示，采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖 1 肺腺癌裸鼠移植瘤生長抑制比較（與PBS組、Ad-GFP組比較，*P＜0.05）。 A：動物實驗大體圖，可見種植后有瘤體生長；B：瘤體重量比較；C：各組瘤體體積-時間變化曲線。Fig 1 Inhibition of human lung adenocarcinoma xenografts by Ad-ING4 (*P＜0.05 compared with PBS and Ad-GFP group). A： The pictures of human lung adenocarcinoma xenografts； B： The weight change of human lung adenocarcinoma xenografts treated with Ad-ING4； C： The curves of tumor volume of human lung adenocarcinoma xenografts after treatment.

2 結(jié)果

2.1 Ad-ING4對裸鼠移植瘤生長的影響 本實驗中成功地建立了SPC-A1肺腺癌裸鼠移植瘤模型，成瘤率為100%。治療15 d后，Ad-ING4組的腫瘤體積及重量明顯小于PBS組和Ad-GFP組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；Ad -ING4組的抑瘤率（33.17%±5.24%）與Ad-GFP組（1.31%±0.31%）比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖1）。

2.2 瘤體組織病理學(xué)檢查 各組瘤體組織進行HE染色，高倍鏡下觀察各組腫瘤組織細胞凋亡情況，腫瘤細胞凋亡的判斷標(biāo)準：細胞體積變小，細胞質(zhì)濃縮，細胞核固縮、碎裂、溶解，組織間有大量空泡形成。結(jié)果顯示：PBS組和Ad-GFP組瘤體組織的腫瘤細胞排列密集，癌細胞異型性明顯，未出現(xiàn)上述細胞凋亡特征；Ad-ING4組中大量細胞呈細胞核固縮、裂解或溶解，細胞質(zhì)濃縮，細胞膜不完整，組織間有大量空泡形成，呈現(xiàn)明顯的細胞凋亡形態(tài)特征（圖2）。

2.3 TUNEL檢測細胞凋亡 結(jié)果顯示，細胞核中有棕黃色著染者為陽性細胞，染色質(zhì)凝聚、濃縮，呈凋亡細胞的形態(tài)學(xué)征象，部分陽性細胞核染色質(zhì)仍很疏松，部分呈圓形深染的棕黃色小體，為典型的凋亡小體。各組凋亡的細胞數(shù)目存在差別，Ad-ING4組的凋亡指數(shù)（69.23%±6.53%），與PBS組（17.04%±1.10%）、Ad-GFP組（18.81%±1.93%）比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.4 瘤體組織中凋亡相關(guān)因子的表達 免疫組織化學(xué)SP法染色結(jié)果顯示，Ad-ING4組的Caspase-3、Fas與FasL陽性細胞數(shù)均明顯高于PBS組和Ad-GFP組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；Ad-ING4組的COX-2陽性細胞數(shù)低于PBS組和Ad-GFP組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表1，圖3）。

表 1 各組腫瘤組織中相關(guān)因子表達的比較Tab 1 Expression change of cytokines in human lung adenocarcinoma xenografts

3 討論

基因治療是將人類的正?；蚧蛴兄委熥饔玫耐庠茨康幕?，通過一定的基因轉(zhuǎn)運系統(tǒng)導(dǎo)入人體靶細胞或直接注入人體，表達具有功能的蛋白質(zhì)，以達到補充、糾正基因的缺陷，從而達到治療疾病的目的[10]。而肺癌是目前世界上發(fā)病率最高的惡性腫瘤，也是癌癥死亡的主要病因之一[11]。因此，針對肺癌的基因治療成為當(dāng)今研究的熱點之一。

本研究采用SPC-A1細胞株建立了肺腺癌裸鼠移植瘤模型，并進行ING4基因治療，治療結(jié)果顯示與對照組（PBS組、Ad-GFP組）比較，Ad-ING4組的腫瘤體積、瘤重明顯減小，抑瘤率明顯增加，TUNEL檢測顯示Ad-ING4組移植瘤的凋亡指數(shù)也增加，說明ING4基因?qū)Ψ伟┛赡芡ㄟ^誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡來抑制腫瘤生長。

細胞凋亡包括兩條主要途徑，即外源性途徑和內(nèi)源性途徑，而細胞凋亡最終都需通過天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶（Caspase）級聯(lián)反應(yīng)來實現(xiàn)，其中Caspase-3處于核心位置，是凋亡級聯(lián)反應(yīng)中的關(guān)鍵蛋白酶[12,13]。張等[6]研究認為ING4能誘導(dǎo)T24膀胱癌細胞中的Bax基因轉(zhuǎn)錄明顯上調(diào)，Bcl-2基因的轉(zhuǎn)錄水平明顯下降，使Bcl-2/Bax的比值下降，最終促使Caspase-3被激活，從而發(fā)揮促凋亡作用。Fas是一種重要的死亡受體，屬于腫瘤壞死因子受體家族（tumor necrosisfactor receptor, TNFR），是細胞凋亡的主要受體分子。FasL為Fas的天然配體，當(dāng)Fas與FasL結(jié)合后可依次激活Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7誘導(dǎo)細胞凋亡[14]；本研究通過免疫組化顯示，Ad-ING4能使肺癌移植瘤細胞中Fas/FasL、Caspase-3陽性細胞數(shù)均明顯增加，表明Fas/FasL凋亡因子上調(diào)，可使Caspase-3被進一步激活，從而加速細胞凋亡。

COX-2是前列腺腺素生成過程中的限速酶，COX-2在包括肺癌在內(nèi)的多種腫瘤組織中均呈高表達，它可通過合成致癌物質(zhì)，從而抑制腫瘤細胞凋亡，促進腫瘤血管新生，促進腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移[15,16]。本研究顯示，Ad-ING4組中COX-2陽性細胞數(shù)明顯下降，表明抑制COX-2的高表達，從而調(diào)節(jié)Caspase-3基因表達水平，可能是ING4基因促進肺癌細胞凋亡作用的另一分子機制。

圖 3 免疫組化染色顯示Caspase-3、COX-2、Fas和FasL的表達 （SP，× 400）Fig 3 Expression change of Caspase-3, COX-2, Fas and FasL（SP, × 400 ）

綜上所述，本研究初步顯示，腺病毒介導(dǎo)的ING4基因?qū)PC-A1肺腺癌裸鼠移植瘤具有生長抑制作用，其機制可能與明顯上調(diào)Caspase-3、Fas/FasL，下調(diào)COX-2的表達相關(guān)；然而ING4的抑癌作用是否還存在其他的分子機制尚有待進一步研究，從而為ING4基因治療肺癌提供更充分的實驗依據(jù)。