自分泌運(yùn)動因子(ATX)抑制劑結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測及其與rPAI-1的分子對接

詹冬玲,鄭明珠,韓葳葳,劉景圣

(1. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,長春 130118； 2. 吉林大學(xué) 分子酶學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,長春 130012)

自分泌運(yùn)動因子(ATX)抑制劑結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測及其與rPAI-1的分子對接

詹冬玲1,鄭明珠1,韓葳葳2,劉景圣1

(1. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,長春 130118； 2. 吉林大學(xué) 分子酶學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,長春 130012)

利用復(fù)合物指紋的虛擬篩選預(yù)測自分泌運(yùn)動因子(ATX)抑制劑的結(jié)合位點(diǎn),并通過與24個(gè)抑制劑(10個(gè)脂質(zhì)和脂基抑制劑,14個(gè)小分子抑制劑)分子對接和動力學(xué)模擬表明,Thr209,Asp172,Tyr306,Phe210,Leu243,Leu213和Phe274是抑制劑結(jié)合位點(diǎn)的重要?dú)埢?且這些殘基均通過側(cè)鏈與抑制劑作用. 利用3D-partner預(yù)測出與ATX結(jié)合的蛋白為纖溶酶原激活物抑制劑1(rPAI-1),并通過同源模擬,得到rPAI-1的分子結(jié)構(gòu). 利用軟件GRAMM將ATX與rPAI-1分子結(jié)構(gòu)相結(jié)合,并通過分子動力學(xué)模擬確定與大分子抑制劑rPAI-1作用的ATX重要?dú)埢鵊lu155和Ala158.

虛擬篩選； 蛋白和蛋白對接； 自分泌運(yùn)動因子

自分泌運(yùn)動因子(ATX),又稱為磷酸二酯酶Ⅰα,是一種分泌型糖蛋白,是胞外焦磷酸酶/磷酸二酯酶(ENPP)家族的一員(ENPP1～ENPP7). ATX屬于ENPP2,具有磷酸二酯酶(PDE)的活性,以溶血磷脂酰膽堿(lysophosphatidylcholjne,LPC)為底物催化生成溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid,LPA)[1-3]. ATX有一個(gè)保守的磷酸二酯酶樣催化結(jié)構(gòu)域,一個(gè)保守的氨基酸(Thr209)和兩個(gè)保守的二價(jià)金屬結(jié)合域(Asp171,Asp311,Asp358,His315,His359,His474). 在水解核苷酸時(shí),Thr209可與核苷形成蘇氨酸共價(jià)中間體,從而誘導(dǎo)磷酸二酯鍵的水解[4]. ENPP參與核苷酸循環(huán)、 骨礦化、 磷脂信號調(diào)控、 細(xì)胞運(yùn)動和細(xì)胞增殖等多種生理過程,其表達(dá)異常時(shí)會導(dǎo)致腫瘤、 骨礦化異常及 Ⅱ 型糖尿病等疾病的發(fā)生[5-8]. ATX在很多腫瘤細(xì)胞中都會高效表達(dá),在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中有重要作用,被認(rèn)為是腫瘤治療中一個(gè)可能的靶位[9]. 本文通過復(fù)合物指紋的虛擬篩選預(yù)測ATX抑制劑的結(jié)合位點(diǎn),即通過分子對接方法預(yù)測ATX與24個(gè)抑制劑(10個(gè)脂質(zhì)和脂基抑制劑,14個(gè)小分子抑制劑)和大分子抑制劑及蛋白纖溶酶原激活物抑制劑1(rPAI-1)的結(jié)合位點(diǎn),為ATX的專有抑制劑設(shè)計(jì)提供理論線索.

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1虛擬篩選

ATX的3D結(jié)構(gòu)[10](PDB code 2xrg)來自PDB數(shù)據(jù)庫. 24個(gè)抑制劑(10個(gè)脂質(zhì)和脂基抑制劑： LPA,S1P,Thiophosphate,cPA-based,3-O-thia-cPA,BrP-LPA,Fluoromethylphenyl,FTY720-P,S32828,Tyrosine-based； 14個(gè)小分子抑制劑： PF-8380,HA155,E-HA219,Vinpocetin,Damnacanthal,NSC-48300,NSC-9616,H2L-7905958,Bithionol,Etazolate,1-Mehty-1,3-isobutylxathine,Rolipram和Mopidamol)的結(jié)構(gòu)來自Chemspider數(shù)據(jù)庫. 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)去水,去配體,加標(biāo)準(zhǔn)H原子. 得分最佳的構(gòu)象用于數(shù)據(jù)庫排序的標(biāo)準(zhǔn). 通過DUDE軟件在線生成與先導(dǎo)化合物物理性質(zhì)類似的化合物[11]1 936個(gè).

使用AutoDock Vina[12],AutoDock 4.2及Ds 2.5中的Ligandfit進(jìn)行對接.ATX結(jié)構(gòu)保持剛性,對接時(shí)考慮小分子的柔性. 預(yù)計(jì)AutoDock Vina,AutoDock 4.2均以ATX自身帶有的抑制劑為中心坐標(biāo),格點(diǎn)為28 nm×28 nm×28 nm. Ligandfit可根據(jù)已有的配體形態(tài)定義結(jié)合腔,能夠設(shè)定這些關(guān)鍵氨基酸上的基團(tuán)作為相互作用篩選標(biāo)準(zhǔn),要求被對接的小分子發(fā)生相應(yīng)的基團(tuán)匹配,形成氫鍵,疏水相互作用且正負(fù)電基團(tuán)匹配,這種化學(xué)基團(tuán)匹配的功能使篩選的結(jié)果更合理,也能使篩選的速度加快. Ligandfit在進(jìn)行分子對接時(shí)應(yīng)用Monte Carlo算法對配體的構(gòu)象空間進(jìn)行取樣,以基于力場參數(shù)的方法進(jìn)行受體和配體分子相互作用的評價(jià).

1.2蛋白-配體相互作用指紋計(jì)算

根據(jù)下面定義的9種分子間相互作用,采用Discovery studio 2.5[13]計(jì)算蛋白-配體相互作用指紋. 9種分子間相互作用分別為： 蛋白與配體的任何作用； 蛋白側(cè)鏈作為氫鍵供體; 蛋白側(cè)鏈作為氫鍵受體; 蛋白主鏈作為氫鍵供體; 蛋白主鏈作為氫鍵受體; 離子作用; 極性作用; 疏水作用; 芳香作用.

通過3D-partner預(yù)測出與ATX結(jié)合的蛋白[14]為鼠源蛋白纖溶酶原激活物抑制劑1 (rPAI-1)(UniProtKB P20961),通過同源分析找到rPAI-1的同源蛋白質(zhì),建立未知rPAI-1蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模型. 在線軟件SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org)是一種可廣泛尋找已知同源蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu),從而模擬所需蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的軟件,本文通過該軟件構(gòu)建出rPAI-1的結(jié)構(gòu),并在此基礎(chǔ)上對模擬的分子進(jìn)行可靠性分析. 利用GRAMM軟件將2個(gè)分子進(jìn)行分子相關(guān)性分析,并通過軟件DS 3.5觀察分子間的連接情況.

1.3同源模建

通過Blast多重序列對比發(fā)現(xiàn),rPAI-1與人源的hPAI-1(PDB code 1oc0)同源性為90%. 通過SWISS-MODEL構(gòu)建rPAI-1的結(jié)構(gòu).

1.4分子動力學(xué)模擬

在NPT(粒子數(shù)N、 溫度和壓強(qiáng)均為定值)系統(tǒng)下,利用Gromacs 4.5.1軟件進(jìn)行復(fù)合物體系的動力學(xué)模擬,在恒定溫度為300 K,恒定壓強(qiáng)為常壓下,采用Gromos96力場,將ATX-PAI-1復(fù)合物放入一個(gè)周期性邊界的立方盒中,并使模擬分子中的所有原子距盒子邊界的距離均大于1.0 nm. 將周期化盒子中充滿SPCE模型的水分子,使模擬體系的總電荷維持為0,以保持溶液的中性條件,采用Gromacs軟件的geion程序在盒子中隨機(jī)加入6個(gè)Na+使體系成為電中性環(huán)境. 體系模擬14 ns,模擬時(shí)間步長為1.0 fs. 在分子動力學(xué)模擬過程中,處理長程靜電相互作用采用PME(particle-mesh ewald)算法,體系原子的初速度滿足Maxwellian分布.

本文對復(fù)合物體系進(jìn)行能量最小化： 1) 采用最陡下降法先優(yōu)化500步,再用共軛梯度法進(jìn)行優(yōu)化； 2) 對復(fù)合物使用位置束縛算法,調(diào)節(jié)溫度為300 K,進(jìn)行500 ps的限制分子動力學(xué)模擬平衡該體系,使模擬體系能量逐漸收斂; 3) 采用NPT系統(tǒng),將完成優(yōu)化后的體系進(jìn)行14 ns的動力學(xué)模擬.

2 結(jié)果與討論

2.1虛擬篩選

圖1 3種對接方法的ROC曲線Fig.1 ROC curves for 3 different methods

通過DUDE軟件生成訓(xùn)練集,使用3種對接軟件進(jìn)行對接,結(jié)果如圖1所示. 由圖1可見,Ligandfit和x軸形成的面積最大,表明Ligandfit的效果最好. 24種小分子抑制劑與ATX的結(jié)合如圖2所示.

由圖2(A)可見,24個(gè)小分子抑制劑均結(jié)合在ATX的同一個(gè)位點(diǎn); 由圖2(B)可見,所有小分子抑制劑均位于ATX的同一個(gè)凹槽內(nèi). 根據(jù)24個(gè)小分子抑制劑和ATX對接時(shí)抑制劑的結(jié)合位點(diǎn)列于表1. 由表1可見,Thr209,Asp172,Tyr306,Phe210,Leu243,Leu213和Phe274是抑制劑結(jié)合位點(diǎn)的重要?dú)埢?與所有抑制劑均作用),且這些殘基均通過側(cè)鏈與抑制劑作用. 其中30%的抑制劑可與Thr209形成金屬鍵(帶有金屬的抑制劑). 72%和60%的抑制劑可分別與Tyr306和Phe274形成p-π共軛. Thr209為催化殘基,His474和His359為金屬結(jié)合位點(diǎn). 圖3(A)為代表性抑制劑,即小分子抑制劑HA155結(jié)合在ATX活性口袋中. 圖3(B)為HA155與ATX殘基形成的氫鍵. 由圖3(B)可見,Asn230中的NH可與抑制劑形成氫鍵. 因此Asn230也是抑制劑結(jié)合的重要?dú)埢? 可見,抑制劑結(jié)合在催化結(jié)合域,且結(jié)合十分穩(wěn)定,使得底物不易進(jìn)入.

表1 24個(gè)小分子抑制劑和ATX對接時(shí)抑制劑的結(jié)合位點(diǎn)(%)Table 1 Averaged structural interaction fingerprints calculated over all successfully docked poses betweenATX and each of 24 small molecule inhibitors presented for all identified interacting residues (%)

2.2蛋白和蛋白的對接

通過3D-partner預(yù)測出與ATX結(jié)合的蛋白[7]為大分子抑制劑rPAI-1. 以人源hPAI-1晶體結(jié)構(gòu)為模板,構(gòu)建鼠源rPAI-1的蛋白結(jié)構(gòu)如圖4所示. rPAI-1蛋白結(jié)構(gòu)的評估結(jié)果列于表2. 由表2可見,rPAI-1的模擬結(jié)構(gòu)和模板hPAI-1的結(jié)構(gòu)相似,是可靠的. 在已知ATX蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)和模擬得到rPAI-1的分子結(jié)構(gòu)后,通過GRAMM軟件對蛋白質(zhì)分子對接的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,結(jié)果如圖5所示.

圖2 24種小分子抑制劑與ATX的結(jié)合方式Fig.2 Binding pose between each of 24 inhibitors and ATX

圖3 小分子抑制劑HA155在結(jié)合口袋(A)及其與ATX殘基間形成氫鍵(B)Fig.3 Small molecule HA155 inhibitor in the binding pocket (A) and hydrogen bond between it and ATX (B)

表2 蛋白結(jié)構(gòu)的評估Table 2 Assessment of protein structure

圖4 rPAI-1的3D結(jié)構(gòu)Fig.4 3D structure of rPAI-1

圖5 ATX和rPAI-1的分子對接Fig.5 Docked complex of ATX-rPAI-1

由圖5可見,ATX與rPAI-1蛋白質(zhì)分子間有連接,與rPAI-1作用的殘基為Ala158和Glu155;rPAI-1上的殘基為Thr161和Asn158; Ala158和Thr161與Glu155和Asn158之間形成氫鍵.

圖6 ATX與rPAI-1作用時(shí)的重要?dú)埢鵉ig.6 Important residues of ATX in the ATX-rPAI-1

對ATX-rPAI-1進(jìn)行分子動力學(xué)模擬,結(jié)果如圖6所示. 由圖6(A)可見,ATX比rPAI-1的RMSD值低,且在14 ns的動力學(xué)模擬過程中變化較小. 這是由于rPAI-1的結(jié)構(gòu)通過建模方式構(gòu)建,可能缺少與其他原子接觸或其他相互作用,因而具有較高的運(yùn)動性和柔性所致. 在10 ns的動力學(xué)模擬后,其RMSD值已經(jīng)穩(wěn)定在約1.8 nm. 在平衡階段(10 ns后),復(fù)合物ATX的RMSD值在約0.25 nm,rPAI-1約為1.8 nm,表明體系的整體結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定,運(yùn)動性很小. 由圖6(B)可見,A158—NH…OG—T161和E155—O…HD22—N158的氫鍵在整個(gè)動力學(xué)過程中十分穩(wěn)定. 表明這幾個(gè)氨基酸都能在空間中保持穩(wěn)定的相對位置,對整個(gè)體系的穩(wěn)定起重要作用. 因此Ala158和Glu155是ATX與大分子抑制劑rPAI-1作用的重要?dú)埢?

綜上所述,本文利用復(fù)合物指紋的虛擬篩選預(yù)測ATX抑制劑的結(jié)合位點(diǎn). 通過動力學(xué)模擬可知,Thr209,Asp172,Tyr306,Phe210,Leu243,Leu213和Phe274是抑制劑結(jié)合位點(diǎn)的重要?dú)埢? 通過3D-partner預(yù)測出與ATX結(jié)合的蛋白為rPAI-1; 通過同源模建,得到大分子抑制劑rPAI-1的分子結(jié)構(gòu); 將ATX與rPAI-1分子相結(jié)合,通過分子動力學(xué)模擬確定與大分子抑制劑rPAI-1作用的重要?dú)埢茿TX的Glu155和Ala158.

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(責(zé)任編輯： 單 凝)

BindingPoseoftheAutotoxin(ATX)InhibitorsPredictedandMolecularDockingwithrPAI-1

ZHAN Dongling1,ZHENG Mingzhu1,HAN Weiwei2,LIU Jingsheng1
(1.CollegeofFoodScienceandEngineering,JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118; 2.KeyLaboratoryforMolecularEnzymologyandEngineeringofMinistryofEducation,JilinUniversity,Changchun130012)

The composite fingerprint virtual screening was used to predicate the binding mode of autotoxin’s (ATX) inhibitor. Our results indicate that Thr209,Asp172,Tyr306,Phe210,Leu243,Leu213,and Phe274 are important residues for binding 24 inhibitors (10 lipid and lipid-based inhibitors and 14 small molecule inhibitors). We also predicted the binding mode of plasminogen activator inhibitor 1 (rPAI-1) to ATX. Under the guidance of GRAMM software,the homology modeling of macromolecule inhibitor rPAI-1 showed it was docked to ATX. Through molecular dynamics simulation,we predicted the important residues Glu155 and Ala158 involved in the binding of macromolecule inhibitor rPAI-1.

virtual screening; protein-protein docking; autotoxin (ATX)

2013-11-25.

詹冬玲(1977—),女,漢族,博士,講師,從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)的研究,E-mail： zdlgale@126.com. 通信作者： 劉景圣(1964—),男,漢族,博士,教授,博士生導(dǎo)師,從事功能食品的研究,E-mail： liujs1007@vip.sina.com.cn.

國家自然科學(xué)基金(批準(zhǔn)號： 30671536).

Q67

A

1671-5489(2014)05-1100-05