轉基因小鼠胃癌模型的研究進展

謝華夏 程向東 徐志遠

胃癌的發(fā)生率在全世界癌癥發(fā)生率中排名第4位，其病死率在所有腫瘤中排名第2位，在我國的發(fā)生率也非常高，總的5年生存率不到25%［1］。構建一個可靠的權威的胃癌動物模型對于研究胃癌的發(fā)病機制，預防和治療方法具有至關重要的意義。在初期的實驗方法都集中在通過化學致癌物質(如MNU、MNNG等)，幽門螺桿菌(Hp)感染等方式來誘導胃癌在小鼠前胃發(fā)生鱗狀細胞癌，并不是人體常見的腺癌，造成這一現(xiàn)象的原因是由于人與小鼠解剖結構的差異［2］。近年來，基因工程技術的快速發(fā)展為新的胃癌小鼠模型的開發(fā)提供了基礎技術支持，使得各種轉基因小鼠模型不斷涌現(xiàn)。本研究對目前常見的幾種轉基因小鼠模型做一綜述。

一、胰島素－胃泌素小鼠

胰島素－胃泌素(INS－GAS)轉基因小鼠起初只是用于研究胃泌素對胰島細胞形成的作用。INSGAS轉基因序列由人胃泌素編碼序列的胰島素啟動子上游組成，轉基因后引起轉基因小鼠的胰腺β細胞中酰氨化胃泌素(主要為G－17)出現(xiàn)過度表達，導致血清中酰胺化胃泌素比正常表達水平高2倍。月齡較小的INS－GAS小鼠出現(xiàn)了最大胃酸分泌量和胃壁細胞總量的增加，不過后期又出現(xiàn)了胃壁細胞的減少(胃萎縮)，高胃泌素血癥加重，以及胃黏膜上皮細胞增生。隨著時間的推移，INS－GAS小鼠(FVB為其遺傳背景)表現(xiàn)出向胃黏膜腸上皮化生和異型增生發(fā)展，小鼠20個月齡時發(fā)展為胃體侵襲性腫瘤［3］。INS－GAS小鼠在感染幽門螺桿菌(Hp)后會加快黏膜內癌的發(fā)生(12個月齡內)，并伴隨著向胃黏膜下和血管內的轉移［4］。

Hp對于INS－GAS小鼠是一個高效的致癌物，多項研究實驗已證實人屬Hp感染INS－GAS小鼠會加速胃癌的發(fā)生。近年來，INS－GAS小鼠這一模型已被廣泛運用與多個領域，特別是檢驗多種重要基因的表達，以及拮抗劑或抑制劑，細菌因素或者共生生物，性別或性激素，凋亡因素在致胃癌中的作用等［3，5～9］。

二、TFF1基因敲除小鼠

TFF包括乳腺癌相關肽(the breast cancer－associated peptide，pS2/TFF1)，解痙多肽(spasmolytic polypeptide，SP/TFF2)和腸三葉因子(intestinal trefoil factor，ITF/TFF3)。TFF1主要表達于胃小凹表面黏液細胞或胃小凹胃壁細胞中，人和小鼠的TFF1蛋白(原名pS2)都屬于三葉草形多肽家族，TFF1異常表達于胃腸疾病和多種腫瘤中。為了進一步了解TFF1的功能，Lefebvre 等［10］通過同源重組構建 TFF1－/－小鼠(F2 129/Svj雜交遺傳背景)的方法干擾小鼠的TFF1基因的表達，其中30%的TFF1表達缺陷小鼠表現(xiàn)出胃上皮細胞增生并伴隨明顯的胃小凹處病變，和上皮內多發(fā)的大病灶甚至浸潤癌。最近一項通過利用TFF1轉基因小鼠模型的研究發(fā)現(xiàn)TFF1沉默會導致調節(jié)NF－κB轉錄因子的NF－κB激活，引起胃癌形成過程中NF－κB調節(jié)的炎癥加強［11］。

TFF2表達于遠端胃深層腺上皮細胞和十二指腸腺的Brunners腺泡細胞，TFF2缺陷的轉基因小鼠胃黏膜在誘導后僅表現(xiàn)出輕微的增生，但是Hp感染TFF2缺陷的小鼠后會出現(xiàn)比野生型(WT)小鼠更為嚴重的胃萎縮性癌前病變損傷、化生、異型增生［12］。這些結論說明TFF2對胃癌前病變的進展以及接下來胃腫瘤的進展起著負性調節(jié)的作用。

三、Gp130突變小鼠

Gp130是細胞因子IL－6和IL－11的一個普通共同受體，Gp130突變小鼠(Gp130F/F小鼠)即為Gp130受體突變的小鼠(通過去除了與Gp130銜接的SHP2－Ras－ERK信號通路)，Gp130F/F小鼠在3個月內即可發(fā)展為胃腺癌［13］。Gp130受體的突變還會使得TFF1基因的下調，Gp130F/F表型的小鼠在很多方面模擬了TFF1－/－小鼠。在胃中Gp130信號通路的主要細胞因子傳遞者是IL－11，還包括胃竇部的 IL－6，也有微弱的活性效應［14］。IL －11 不僅能夠促進胃慢性炎癥，還通過過度激活 STAT3和STAT1與腫瘤的發(fā)生聯(lián)系在一起［15］。

四、H/K－ATPase－IL－1β轉基因小鼠

白細胞介素1β(interleukin－1β，IL－1β)是第 1個被發(fā)現(xiàn)的白細胞介素，最初發(fā)現(xiàn)其主要功能是作為內生性致熱源參與炎性反應。近年來的研究表明，IL－1β與腫瘤轉移的關系也很密切。在IL－1β結構的多樣性引起了其信號通路的多樣性，這種多樣性會增加患多種腫瘤的風險，特別是胃癌［16］。Tu等［17］通過利用鼠H/K－ATPase的啟動子直接使小鼠特異性的表達出具有人體內同樣結構活性的IL－1β，這種小鼠即為H/K－ATPase－IL－1β轉基因小鼠。H/K－ATPase－IL－1β轉基因小鼠(C57BL/6為其遺傳背景)表現(xiàn)出自發(fā)性的胃炎，慢性進展的胃萎縮(時間超過1.5年)、化生，直至進展為胃癌。另外，這些在感染Hp后有強烈的協(xié)同效應，并迅速進展為胃癌(時間在1年內)。因此，H/K－ATPase－IL－1β轉基因小鼠證實了在患者的IL－1β的表達提高會提高患胃癌的風險，而且能夠協(xié)同Hp的感染效應促使腫瘤的形成。

IL－1β轉基因小鼠進展為胃癌的分子機制早已被提出。在一項研究中發(fā)現(xiàn)，IL－1β轉基因小鼠的確表現(xiàn)出了骨髓來源的抑制細胞(MDSCs)的聚集現(xiàn)象［18］。最近的一個研究中發(fā)現(xiàn)在部分細胞中通過抑制胃酸分泌和細胞內鈣離子的釋放能抑制Shh(Sonic Hedgehog)基因的表達，并伴隨胃萎縮［19］。H/KATPase－IL－1β小鼠模型的出現(xiàn)，對研究基質細胞，腫瘤相關纖維母細胞(CAFs)和炎性細胞在形成腫瘤的微環(huán)境中的重要地位具有重要意義。Quante等［20］報道稱，至少20%的CAFs來源于骨髓(BM)的間充質干細胞(MSCs)，來源于CAFs的MSCs被召集到異型增生的胃表達IL－6，Wnt5a和 BMP4，并表現(xiàn)出DNA的低甲基化，這對于腫瘤生長有促進作用。而且，CAFs在依賴基質細胞衍生因子的過程中涉及到一個壁龕的形成，這個壁龕用來促進腫瘤的形成過程［21］。因此，IL－1β轉基因小鼠模型結合其他的轉基因小鼠的研究，應該有助于進一步闡明腫瘤早期啟動機制及胃黏膜上皮與基質各組成成分之間的相互作用機制。

五、K－ras轉基因小鼠

K－ras在多種人體腫瘤中最普通的變異原癌基因之一。過去，研究者為了進一步分析小鼠中致腫瘤基因K－ras在胃癌進展中的功能，常將定向表達于胃頸/峽部的K19啟動子用來介導調節(jié)K－ras－V12變異基因的表達。K19－K－ras－V12轉基因小鼠(F2 mixed C57BL/6×DBA為遺傳背景)出現(xiàn)了早期的趨化因子(如CXCL1)的上調和源于骨髓的炎性細胞及成纖維細胞的聚集，伴隨壁細胞的逐漸丟失，化生和異性增生。在某種意義上，K19－K－ras－V12轉基因小鼠與H.felis(貓屬Hp)誘導的致胃癌作用和胃腫瘤的形成的機制是非常相似的［22］。因此，這些研究表明具有K－ras依賴效應的慢性炎癥可引起骨髓源細胞的聚集(形成了基質微環(huán)境)，進而啟動了致胃癌效應。

在一項研究中，研究者在K19陽性的成熟小鼠中通過基因敲入K19－CreERT，形成LoxP－STOPLoxP－KrasG12D小鼠，從而引入一個條件性的K－ras G12D變異，這些小鼠的表現(xiàn)出胃中多發(fā)異性增生、化生、腺癌，而這些表現(xiàn)同樣出現(xiàn)在口腔、結腸、肺［23］。另一組研究為了判斷K－ras激活后效應的廣泛性和系統(tǒng)性，將UBC9－CreERT轉基因小鼠與LoxP－STOP－LoxP－KrasG12D小鼠進行了雜交，得到的小鼠體內激活的K－ras廣泛存在，并表現(xiàn)出前胃和胃腺的重度炎癥、化生、異型增生、祖細胞激活現(xiàn)象［24］。這些后面的結果表明在所有組織中，K－ras是處于激活狀態(tài)的，而K－ras的變異使胃更易發(fā)生感染或者炎性反應，這說明K－ras在胃的癌前改變中可能起著關鍵性的作用。

六、胃癌的其他轉基因小鼠模型

下面將會討論已被報告的其他轉基因小鼠模型，它們包括對 TGF－β/Smad通路，RUNX3、p53和CDH1進行的基因改變。在胃癌中，TGF－β/Smad信號通路普遍出現(xiàn)改變，敲出TGF－β1的小鼠(混有C57BL/6/Sv/129的遺傳背景)的胃出現(xiàn)嚴重的上皮異型增生和化生［25］。然而，最近有研究指出通過細胞因子的誘導使T細胞特異性的刪除Smad4，這不僅會誘導胃癌的發(fā)生、結腸腫瘤、十二指腸腫瘤、口腔腫瘤也會出現(xiàn)［26］。RUNX3是RUNX基因家族的成員之一，RUNX3調節(jié)Smad基因家族的轉錄和TGF－β信號通路。RUNX3基因敲出的小鼠(第2子代)表現(xiàn)出胃黏膜中胃腺細胞增多，且細胞的增生力增強［27］。Ito等［28］最近報道稱RUNX3基因敲除小鼠(Balb/c為其遺傳背景)表現(xiàn)出主細胞的缺失和SPEM型化生出現(xiàn)，也顯示出對MNU誘導腺癌更高的敏感度。

最近Shimada等［29］通過H/K－ATPase啟動子研究出針對性的CDH1和p53雙基因敲出小鼠。在這些雙基因敲出的小鼠中，浸潤性和由印戒細胞組成的侵襲性腫瘤出現(xiàn)在小鼠6～9個月齡時，而僅僅只敲出CDH1的小鼠沒有進展為腫瘤。這些現(xiàn)象支持了CDH1在上皮彌漫性胃癌中起著至關重要的作用的觀點，但是小鼠進展為胃癌不僅僅需要CDH1的缺失，還需要其他突變或者致癌因子的作用。

七、展 望

在研究腫瘤發(fā)生的分子機制、病理機制及腫瘤浸潤、轉移以及抗癌藥物篩選的過程中，選擇和建立一個穩(wěn)定成熟的胃癌小鼠模型至關重要。研究人員可以根據自己研究的需要，從不同特點的模型中選擇出適合自己實驗的模型(表1)。

轉基因胃癌模型是直接將調控胃癌的相關基因轉染到動物胚胎中而形成腫瘤，其形成腫瘤的形態(tài)特征與人類腫瘤的自然發(fā)生極為相似，且發(fā)生于特定組織，特異性高，因此轉基因動物在胃癌形成、發(fā)展機制尤其是信號通路研究中具有獨特的優(yōu)勢。然而，轉基因動物模型也有其缺點，即制作成本較高，技術難度較大，在許多的實驗室仍難以普及。但隨著現(xiàn)代分子生物學的不斷發(fā)展，轉基因模型因其獨特的優(yōu)勢使其必將成為未來研究胃癌的主要動物模型。

表1 主要胃癌轉基因動物模型對比

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