胃癌腹膜種植轉移動物模型建立的研究進展

湯加寧 程向東 徐志遠

胃癌嚴重危害人類健康，在各類惡性腫瘤死因中排名第2位[1]。腹膜轉移是胃癌進展過程中以及胃癌患者術后復發(fā)的常見現(xiàn)象，當發(fā)生腹腔種植后，其治療效果往往不佳，5年生存率低于20%[2]。有研究者回顧性研究1172例胃癌RO切除術患者，胃癌腹膜轉移的發(fā)生率為29%，且患者的中位生存時間只有6個月[3]。因此，迫切需要一個成熟、穩(wěn)定、可靠、價廉的胃癌腹膜種植轉移動物模型，這將有助于研究胃癌腹膜轉移機制，檢測各類抗胃癌藥物療效，進一步提高臨床治療策略，從而改善患者預后。有研究者曾采用Hp(幽門螺桿菌)感染小鼠，N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍(N-methyl-N'-Nitro-N-Nitrosoguanidine，MNNG)、硝酸、乙醇等化學致癌物質誘導Wister鼠等動物形成胃癌[4，5]。這些方法，原位胃癌成瘤時間長(要等10個月或者更久)，腹膜成瘤率低，且對于實驗人員有潛在Hp感染和化學致癌危險。還有研究者采用基因工程技術建立胃癌轉基因小鼠如p53/CDH1(一種通過歷時12個月的基因敲除技術形成于胃體的低分化腺癌小鼠模型)等[6]。此種方法雖能特異性的形成胃癌模型，但其成瘤時間長、代價巨大，不符合大批量的動物實驗研究。這些年來，國內(nèi)外主要采用細胞系建立胃癌腹膜種植轉移動物模型，具有成瘤周期短、成瘤率高、可以根據(jù)不同實驗目的建立針對性模型等特點，極大推動了胃癌腹膜轉移的研究。

一、采用細胞系建立胃癌腹膜種植轉移動物模型的方法

1.胃癌灶原位移植形成腹膜轉移癌:目前最常用的宿主動物有:T細胞功能缺陷的BALB/c-nu/nu裸小鼠，T、B細胞功能聯(lián)合免疫缺陷的SCID鼠，T、B、NK細胞聯(lián)合免疫缺陷的BNX小鼠。一般選用6～8周齡的雄性鼠。上述實驗動物具有不同程度免疫缺陷，為了降低宿主動物感染致死率，通常采用SPF級動物(specific pathogen-free animal)標準飼養(yǎng)。SPF級動物飼養(yǎng)于具有嚴格屏障體系的環(huán)境中，該環(huán)境對于實驗員、動物飼料和空氣的出入都有嚴格要求[7]。

所用胃癌灶原位移植瘤組織主要來源于胃癌細胞株(SGC-7901、MKN-45、AGS、NCI-N87、SNU-16、MGC-803等)經(jīng)宿主動物皮下注射所形成的皮下瘤。待瘤體長到直徑0.8～1.0cm時，剔除包膜等其他組織，選取新鮮魚肉狀瘤塊，切成1mm3大小的小瘤塊作為原位移植瘤源。然后將這些小瘤塊移植于胃竇部近大彎側漿膜處，在宿主動物生存期內(nèi)將形成腹膜轉移瘤。

將小瘤塊移植于胃竇部有多種方法:如“懸掛法”、“胃囊法”、“OB膠粘貼法”、“纖維蛋白原-凝血酶法”[8～10]。(1)“懸掛法”:直接接將腫瘤以7-0的絲線縫掛于漿膜層，操作簡便、快速，但有可能術后脫落，故較少運用。(2)“胃囊法”:指在漿膜處造一個2mm長的創(chuàng)口，將小瘤塊置入漿膜層缺損處后采用荷包縫合，或是充分游離漿膜，在局部區(qū)域造成一小囊，而后將瘤塊置于小囊中，再縫合囊袋，使瘤塊整體被包埋于胃壁的漿膜層與黏膜層之間。(3)“OB膠黏貼法”:指用一次性注射針頭輕度損傷胃大彎中部漿肌層，以出血為度，將腫瘤小塊用醫(yī)用OB膠黏合在損傷處。(4)“纖維蛋白原-凝血酶法”:用無菌空針頭輕微劃破胃竇漿肌層，置入3～4塊小瘤塊(1mm3大小)，滴上約10滴凝血酶以覆蓋瘤組織表面，待凝血酶與纖維蛋白原反應(約10s)，使得小瘤塊附著于胃上。

胃癌灶原位移植形成腹膜轉移癌的建模方法，模擬了人體內(nèi)胃癌的自然生長和腹膜轉移過程。移植瘤組織保留了胃癌細胞與細胞外的微環(huán)境，其完整性避免了腫瘤的生物學行為遭到破壞。建立這種模型不僅再現(xiàn)了胃癌的侵襲轉移過程，而且可以通過測定相關分子的表達，探究胃癌轉移機制。胃癌灶原位移植的成功率都比較高。但是由于胃癌細胞系的差異以及宿主動物各個品系的差異，建模方法的差異，各宿主動物的生存時間的差異，腹膜瘤形成的靶向不確定性，造成了腹膜瘤形成的比率存在較大差異，詳見表1。

表1 胃癌灶原位移植形成腹膜轉移癌的模型比較

2.經(jīng)皮下穿刺腹腔注射瘤細胞形成腹膜癌:將細胞株制成細胞懸液(濃度數(shù)量級一般為106以上)，經(jīng)皮下穿刺腹腔注射形成腹膜瘤。這種方法模擬了胃癌細胞自然脫落形成腹膜瘤的過程，具有簡單、易操作、創(chuàng)傷小的優(yōu)點，深受研究者歡迎。Zhang等[14]選用裸鼠和SCID鼠經(jīng)皮穿刺腹腔注射胃癌細胞株AGS、NCI-N87和 SNU-16構建腹膜種植瘤模型。探索出將(20～40)×106個 SNU-16細胞經(jīng)腹腔注射到SCID鼠中，能夠構建穩(wěn)定實用的胃癌腹膜種植瘤模型。該模型的SCID鼠中位生存期為44～78天，可以為抗癌藥物的研究，提供一個寬闊的時間窗。該模型中不同的細胞系，不同宿主動物經(jīng)皮穿刺腹腔注射成瘤率比較，詳見表2。

表2 經(jīng)皮下穿刺腹腔注射法形成腹膜轉移癌比較

3.其他方法:(1)開腹胃黏膜下注射瘤細胞法:將宿主動物開腹后，將瘤細胞懸液注射于胃黏膜下，繼而形成腹膜癌。(2)開腹后瘤塊包埋法:用眼科鑷將體積為1.0～2.0mm3的瘤塊(細胞系接種宿主動物皮下成瘤所得)包埋于胃竇部大網(wǎng)膜內(nèi)。梅列軍等[15]用兔VX2瘤細胞采用開腹胃黏膜下注射瘤細胞法、開腹后瘤塊包埋法、經(jīng)皮穿刺瘤細胞懸液注射法在新西蘭大白兔上建立大動物的腹膜轉移癌模型。這3種方法構建模型的成功率分別是100%(12/12)、91.7%(11/12)和58.3%(7/12)，呈現(xiàn)出開腹法與經(jīng)皮穿刺法相比有顯著性差別。

二、成功建立胃癌腹膜種植轉移動物模型的鑒定

為了鑒定以上幾種建模方法造模是否成功，研究員通常在宿主動物出現(xiàn)消瘦、乏力、厭食、腹腔積液、腹部包塊等惡病質癥狀時，將宿主動物開腹直接用肉眼觀察腹腔內(nèi)腫瘤情況，包括大小、部位、質地，有無局部區(qū)域侵襲播散等，而對于那些肉眼可疑部位進行取材，借助病理學檢查加以篩選。

三、采用細胞系建立胃癌腹膜種植轉移動物模型的應用

1.胃癌腹膜轉移機制的研究:胃癌腹膜轉移涉及黏附、降解、移動、血管生成等多個階段，每一階段都有不同種類基因的改變和多種生物學活性物質的介入[16]。王殿棟等[17]采用裸鼠腹腔注射 SGC-7901法建立胃癌腹膜轉移模型，聯(lián)合運用基因芯片技術篩選出數(shù)百個胃癌腹膜轉移的差異性表達基因。實驗研究結果為研究與胃癌腹膜轉移的有關基因提供了理論依據(jù)并具有一定的參考價值。吳濤等[18]用SGC-7901建立裸鼠腹膜癌轉移模型，論述轉化生長因子β1(TGF-β1)小干擾RNA抑制SGC-7901腹膜轉移。Miyake等[19]通過將HIF-1α敲除的胃癌細胞系采用腹腔注射法建立腹膜種植轉移模型，結果發(fā)現(xiàn)HIF-1α在腹膜轉移癌形成過程中具有促進腫瘤血管形成的作用。

2.抗癌藥物動力學及抗癌藥效應的研究:Mori等[20]用MKN-45在BALB/c-nu/nu裸小鼠上建立模型，證明口服抗癌藥S-1(一種口服的氟尿嘧啶衍生物)具有抑制腹膜轉移瘤形成，提高裸小鼠生成率的效應。Aoyagi等[21]在 BALB/c-nu/nu裸小鼠上采用腹腔注射胃癌腹膜高轉移細胞系MKN-45P法建立胃癌腹膜轉移模型，研究表明貝伐單抗能抑制血管內(nèi)皮生長因子，抑制胃癌腹膜播散。Oh等[22]在BALB/c-nu/nu裸鼠腹腔注射AGS建立腹膜轉移模型，研究WIN55，212-2(大麻素受體激動劑)的抗癌作用。

3.腹腔熱灌注療法(hyperther-mic intraperitoneal chemotherapy，HIPEC)的抗癌療效研究。董怡民等[23]在BA-LB/c-nu/nu裸小鼠行腹腔注射SGC-7901建立模型，證明納米活性炭吸附氟尿嘧啶具有提高腹腔內(nèi)化療的效果。Tang等[24]用兔VX2細胞株在新西蘭大白兔上建立胃癌腹膜轉移癌模型，發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞減滅術聯(lián)合多西紫杉醇、卡鉑腹腔熱灌注可顯著延長發(fā)生胃癌腹膜轉移的新西蘭大白兔的生存時間。

四、展 望

用細胞系建立胃癌腹膜種植轉移動物模型彌補了Hp感染、化學物質誘導動物形成胃癌時間長，腹膜成瘤率低的缺點，也克服了胃癌轉基因小鼠價格之昂貴的不足。而筆者介紹的上述幾種方法，雖具有腹膜成瘤率高，安全性好，成本低的優(yōu)點，但仍存在成瘤時間相對較長(數(shù)月之久)，成功建模動物篩選的主觀性(肉眼觀察)、復雜性(病理學檢測)，宿主動物體型偏小(裸小鼠、BNX鼠、SCID鼠)的缺點。為成功建立成熟、穩(wěn)定、可靠、價廉的胃癌腹膜種植轉移動物模型，筆者認為應該從以下3個方面改進:(1)進一步篩選高效的腹膜種植轉移細胞系。Koga等[25]建立了腹膜高轉移的MKN45-P細胞系，白飛虎等[26]順利地構建了胃癌腹膜高轉移細胞系GC9811-P。(2)采取客觀的方法篩選出發(fā)生腹膜種植轉移的宿主動物。Kaneko等[27]采用綠色熒光蛋白標記的人胃癌細胞系MKN-45建立腹膜癌轉移模型，當用熒光立體顯微鏡時，就可發(fā)現(xiàn)腹膜直徑150μm大小的微轉移癌。這種方法可以客觀地篩選出腹膜種植的宿主動物。(3)尋找更大更適宜手術干預的宿主動物。畢竟免疫缺陷小鼠體型較小，有效循環(huán)血量少，不利于手術干預。梅烈軍等[15]和 Tang等[24]用兔 VX2瘤株建立兔VX2腹膜轉移癌模型，但此法筆者認為有些瑕疵，畢竟VX2為SHOP病毒在兔身上誘發(fā)出誘發(fā)型乳頭狀瘤后，經(jīng)過惡變成為鱗癌，非腺癌，不同于人常見的胃腺癌，況且VX2瘤并不是人胃來源的腫瘤。但該模型為研究腹膜各類轉移癌提供了較好的科研平臺。眾所周知，裸小鼠、SCID鼠、BNX鼠都是基因工程產(chǎn)物。隨著科學技術的法展，分子生物學領域的不斷拓展，更好更經(jīng)濟更適合科研需要的宿主動物的產(chǎn)生應當不是問題?？傊?，建立胃癌腹膜種植轉移模型的細胞系、宿主動物的種類，采用的成瘤方式很多，我們可以通過以上3個方面的改進，進一步完善模型，繼而建立出適合不同種應用目的的胃癌腹膜種植轉移動物模型。

1 Crew KD，Neugut AI.Epidemiology of gastric cancer[J].World J Gastroenterol，2006，12(3):354-362

2 朱正綱.充分重視胃癌腹膜轉移的預防、診斷與治療[J].外科理論與實踐，2003，8(1):16-17

3 Glockzin G，Piso P.Current status and future directions in gastric cancer with peritoneal dissemination[J].Surg Oncol Clin N Am，2012，21(4):625-633

4 曾志榮，胡品津，林漢良，等.幽門螺桿菌感染與胃癌形成關系的動物實驗研究[J].中國醫(yī)師雜志，2002，4(5):454-457

5 徐晶瑩，李益民，李玉蘭，等.MNNG誘導大鼠胃癌模型的建立[J].哈爾濱醫(yī)科大學學報，2003，37(2):104-106

6 Shimada S，Mimata A，Sekine M，et al.Synergistic tumour suppressor activity of E-cadherin and p53 in a conditional mouse model for metastatic diffuse-type gastric cancer[J].Gut，2012，61:344-353

7 吳志邦，趙明德，龔林，等.SPF級動物的飼育設施與環(huán)境維護[J].瀘州醫(yī)學院學報，2007，30(5):431，362

8 劉少平，張玨，袁靜萍，等.胃癌灶原位移植腹膜轉移癌裸小鼠模型的建立及生物學性狀鑒定[J].中華實驗外科雜志，2012，29(10):2082-2084

9 陳亞琳，魏品康，許玲，等.采用OB膠粘貼法建立人胃癌裸鼠原位種植轉移模型[J].癌癥，2005，24(2):246-248

10 黃玲，朱偉，許曉蒙，等.“纖維蛋白原-凝血酶”法建立人胃癌組織塊裸鼠胃癌原位移植模型[J].江蘇大學學報:醫(yī)學版，2010，20(1):29-31

11 姚明，閆明霞，周光興，等.BNX小鼠人胃癌原位移植模型的建立及其生物學特性的觀察[J].腫瘤，2004，24(6):566-569

12 林奇，周士福.人胃癌裸鼠原位移植和轉移模型的建立及其生物學特性觀察[J].徐州醫(yī)學院學報，2008，28(7):446-449

13 閆明霞，許蘭文，姚明，等.兩種免疫缺陷動物人胃癌原位移植模型的腫瘤生物學特性研究[J].上海實驗動物科學，2005，25(1):8-12

14 Zhang C，Awasthi N，Schwarz MA，et al.Establishing a peritoneal dissemination xenograft mouse model for survival outcome assessment of experimental gastric cancer[J].Surg Res，2013，182(2):227-234

15 梅列軍，楊肖軍，李雁，等.兔VX2腹膜轉移癌模型的建立及轉移特征研究[J].中國腫瘤臨床，2009，36(9):523-526

16 朱志，徐惠綿.胃癌腹膜轉移的相關基因[J].國際腫瘤學雜志，2008，35(3):202-205

17 王殿棟，段建中，張克實，等.胃癌腹膜轉移相關基因的動物實驗研究[J].中國腫瘤外科雜志，2010，2(6):331-335

18 吳濤，徐惠綿，吳曉華，等.轉化生長因子β1小干擾RNA抑制SGC-7901 腹膜轉移[J].中華醫(yī)學雜志，2006，86(5):343-345

19 Miyake S，Kitajima Y，Nakamura J，et al.HIF-1α is a crucial factor in the development of peritoneal dissemination via natural metastatic routes in scirrhous gastric cancer[J].Int J Oncol，2013，43(5):1431-1440

20 Mori T，F(xiàn)ujiwara Y，Yano M，et al.Experimental study to evaluate the usefulness of S-1 in a model of peritoneal dissemination of gastric cancer[J].Gastric Cancer，2003，6(Suppl 1):13-18

21 Aoyagi K，Kouhuji K，Miyagi M，et al.Molecular targeting therapy using bevacizumab for peritoneal metastasis from gastric cancer[J].World Crit Care Med，2013，2(4):48-55

22 Oh JH，Lee JY，Baeg MK，et al.Antineoplastic effect of WIN 55，212-2，a cannabinoid agonist，in a murine xenograft model of gastric cancer[J].Chemotherapy，2013，59(3):200-206

23 董怡民，沓小容，姚崇舜，等.納米活性炭吸附氟尿嘧啶在胃癌荷瘤裸鼠體內(nèi)釋放及抑瘤作用的觀察[J].中華腫瘤防治雜志，2008，15(23):1768-1770

24 Tang L，Mei LJ，Yang XJ，et al.Cytoreductive surgery plus hyperthermic intraperitoneal chemotherapy improves survival of gastric cancer with peritoneal carcinomatosis:evidence from an experimental study[J].Transl Med，2011;9:53

25 Koga A，Aoyagi K，Imaizumi T，et al.Comparison between the gastric cancer cell line MKN-45 and the high-potential peritoneal dissemination gastric cancer cell line MKN-45P [J].Kurume Med，2011，58(3):73-79

26 白飛虎，李來生，郭新寧，等.胃癌腹膜高轉移潛能細胞系的建立及其生物學特性[J].腫瘤防治研究，2006，33(3):144-147

27 Kaneko K，Yano M，Tsujinaka T，et al.Establishment of a visible peritoneal micrometastatic model from a gastric adenocarcinoma cell line by green fluorescent protein [J].Int J Oncol，2000，16(5):893-898