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    羊性別控制技術(shù)研究進(jìn)展

    2021-01-15 20:32:24趙曉錕楊江峰
    關(guān)鍵詞:囊胚精氨酸輸精

    張 雷,趙曉錕,楊江峰,張 瑩,王 凈

    (河北北方學(xué)院 動物科技學(xué)院,河北 張家口 075131)

    羊性別控制技術(shù)是通過人為干預(yù)方法使成年雌性動物按性別需求生產(chǎn)后代的一項(xiàng)技術(shù)[1]。性別控制能充分發(fā)揮公、母畜的繁殖性能,消除有害基因,提高遺傳選擇強(qiáng)度,保護(hù)珍稀瀕危生態(tài)資源,優(yōu)化商品動物,獲得優(yōu)質(zhì)的毛、皮、絨、肉、乳等畜產(chǎn)品,使經(jīng)濟(jì)效益最大化[2]。羊性別控制的途徑主要有3種:(1)X和Y精子的頭部、DNA含量、精子膜電荷量的分布位置、含有的抗原以及對抗原的反應(yīng)能力等方面存在差異[3],通過這些特點(diǎn),在受精前干預(yù)精子可控制動物性別;(2)利用細(xì)胞遺傳學(xué)方法、免疫學(xué)方法、分子生物學(xué)方法等對受精后的早期胚胎進(jìn)行性別鑒定;(3)調(diào)控受精前母畜生殖器官的內(nèi)環(huán)境,達(dá)到有效精子和卵子結(jié)合的目的[4]。

    1 X、Y精子分離

    1.1 沉降法

    Y精子的體積比X精子的體積小,沉積速率慢。張岳周報道將新鮮精液稀釋、沉淀2 h后,取2 mL頂層精液、6 mL底層精液經(jīng)洗液、稀釋處理后,制成顆粒冷凍精液,解凍后輸精發(fā)現(xiàn),頂層精液的后代公羔占比為36.4%,母羔占比為63.3%;底層精液的后代公羔占比為75%,母羔占比為25%[5]。張岳周再驗(yàn)證這一試驗(yàn),將鮮奶稀釋2倍后的羊精液裝于試管中,在廣口保溫瓶內(nèi)低溫自然沉淀2 h后從頂層和底層分別取0.1 mL精液進(jìn)行授精,結(jié)果輸入頂層精液的后代公羔占比為70.5%,底層精液的后代母羔占比為70.9%[5],與上次結(jié)果不同。張淑娟報道X精子與Y精子的比重差異并不大,只存在0.007 g·cm-3的密度差異[6],因此對操作要求非常嚴(yán)格,并且由于精子不同的成熟時期比重也不同,所以沉降法的效果存在誤差,不是很準(zhǔn)確。

    1.2 電泳法

    精子表面帶電荷量X精子頭部較高,Y精子尾部較高,在電場中向不同電極移動[7]。用此方法分離牛精子后人工授精,向陽極移動的精子后代雌性占71.3%,向陰極移動的精子后代雄性占63.9%[5]。在pH為7.4條件下用此方法處理人精液,結(jié)果80%的Y精子靠近負(fù)極[6]。

    1.3 梯度離心法

    李平等[8]報道用此法首次對兔的精子分離,受精后發(fā)現(xiàn)后代性別無顯著改變。張岳周報道根據(jù)精子的比重關(guān)系分離精子,把稀釋后的羊精液離心5 min,取上清液對29只母羊人工授精,后代公羔率為78.13%;取下液輸精對24只母羊人工授精,后代母羔率為76%[5]。且離心過程會對精子造成一系列損害,如畸形、活力下降。

    1.4 免疫學(xué)分離法

    Y精子具有H-Y抗原特性,利用H-Y抗血清免疫反應(yīng)區(qū)分X和Y精子,雌仔兔比例達(dá)到78.9%[9]。此法操作方便、成本低,但需要長時間處理精子,從而降低了精子的活力[4]。

    1.5 流動細(xì)胞光度測定法

    不同哺乳動物X精子與Y精子的DNA含量不同,X精子比Y精子的DNA含量高,人、兔、豬、牛、犬、馬、羊X精子DNA含量分別比Y精子多2.8%、3.0%、3.6%、3.8%、3.9%、4.1%、4.2%[9-10]。DNA含量差別較大的動物精液分離難度較小,當(dāng)DNA含量差別小于3%時,分離難度很大[11-12]。激光激發(fā)時,由于X精子DNA含量較高放射出較強(qiáng)的信號,通過儀器和計算機(jī)系統(tǒng)擴(kuò)增可區(qū)分X精子和Y精子。這一技術(shù)被廣泛應(yīng)用于家兔、豬、綿羊和牛的精子分離,并產(chǎn)生了相應(yīng)的性別控制后代。經(jīng)過分離的精子頂體完整性得到改善,穿透宮頸粘液的能力降低,受精卵的壽命縮短,導(dǎo)致牛后代的生長能力比未進(jìn)行分離的差,但這種情況在羊的精子分離上沒有體現(xiàn),有待進(jìn)一步研究其原因[13-14]。此方法分離后的X、Y精子冷凍保存,解凍后進(jìn)行人工受精也能夠產(chǎn)生預(yù)期性別的羔羊[15-16]。近年來流式細(xì)胞儀不斷改良,分離精液的準(zhǔn)確度和分離速度大大提高,但分離過程會損傷精子,儀器價格比較昂貴,一般實(shí)驗(yàn)室難以配置[17]。

    2 早期胚胎性別鑒定

    2.1 細(xì)胞學(xué)方法

    通過分析部分胚胎細(xì)胞的染色體組成可判斷胚胎性別,雌性為XX染色體,雄性為XY染色體,雌性胚胎中的一條X染色體在早期發(fā)育過程中處于暫時失活狀態(tài)[18]。取胚胎滋養(yǎng)層中細(xì)胞,用秋水仙素處理并染色,檢查中期染色體的譜帶差異,根據(jù)X染色體和Y染色體的大小及形態(tài)鑒定性別[19]。李平等[8]報道14-15日齡的牛胚胎中有58.5%可以鑒定,后代的性別與鑒定結(jié)果一致。在生產(chǎn)實(shí)踐中采集細(xì)胞的過程容易損傷胚胎,獲得高質(zhì)量的中期染色體分裂相也很困難[20]。

    2.2 免疫法

    根據(jù)雄性胚胎上存在特異性H-Y抗原,用H-Y抗血清或H-Y單克隆抗體檢測,從而鑒定胚胎的性別。

    2.2.1 細(xì)胞毒性分析法 在胚胎培養(yǎng)過程中,加入H-Y抗血清與補(bǔ)體(豚鼠血清),將發(fā)育良好的胚胎定為H-Y-(雌性),而出現(xiàn)卵裂球溶解或者發(fā)育不完全的定為H-Y+(雄性)[21]。

    2.2.2 間接免疫熒光法 使用單抗或H-Y抗血清與8細(xì)胞至囊胚期胚胎共同孵育培養(yǎng)30 min,再用標(biāo)記有異硫氰酸熒光素(FITC)的二抗進(jìn)行處理,通過熒光顯微鏡觀察,雄性胚胎被熒光標(biāo)記,不顯示熒光的為雌性胚胎,經(jīng)移植到母鼠后,根據(jù)所產(chǎn)的后代,雄胚符合率為78%,雌胚符合率為81%[21]。該方法對豬、綿羊和牛胚胎性別鑒定準(zhǔn)確率分別為81%、85%和89%[8]。

    2.2.3 囊胚形成抑制法 利用H-Y抗體具有可逆性抑制桑椹胚向囊胚發(fā)育階段雄性胚胎的特點(diǎn)。研究者將大鼠桑葚時期的胚胎與H-Y抗體共孵育6 h,發(fā)育成囊胚的判定為雌性,不能發(fā)育成囊胚的判定為雄性。雄性胚胎被去除H-Y抗體,繼續(xù)培養(yǎng)后仍可發(fā)育成囊胚[21]。雌性胚胎和雄性胚胎被移植后,得到79%的雌鼠和91.3%的雄鼠。利用此法對奶牛的胚胎進(jìn)行性別鑒定,雌性胚胎的準(zhǔn)確率為81.82%,雄性胚胎的準(zhǔn)確率為80%[21]。

    2.3 分子生物學(xué)法

    根據(jù)Y染色體上存在SRY基因,用雄性特異性基因探針和PCR擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行性別鑒定,Y染色體上檢測出SRY基因?yàn)樾坌?,否則判斷為雌性[22-23]。

    2.3.1 DNA探針法 根據(jù)Y染色體基因序列設(shè)計并合成DNA探針,雜交標(biāo)記胚胎中的細(xì)胞,陽性者為雄性胚胎,陰性者為雌性胚胎。有學(xué)者針對牛的Y染色體合成DNA多條探針,標(biāo)記胚胎囊胚期細(xì)胞,經(jīng)鑒定,準(zhǔn)確率達(dá)到95%[4]。

    2.3.2 PCR擴(kuò)增法 PCR法鑒定胚胎性別的實(shí)質(zhì)是對Y染色體上的性別決定基因SRY的鑒定。早期胚胎用切割法或吸取法進(jìn)行活組織取樣,設(shè)計SRY基因的特異性引物,然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增,通過是否能擴(kuò)增出目標(biāo)條帶,判斷胚胎的性別,若能則為雄性胚胎,若不能則為雌性胚胎[24]。黃淑楨等[25]鑒定試管羊胚胎性別,將124枚用PCR技術(shù)鑒定的胚胎移植給44只受體母羊,生產(chǎn)14只羔羊,其性別與胚胎鑒定的性別完全一致。但擴(kuò)增時間約2~3 h,時間較長。近年來隨著PCR擴(kuò)增技術(shù)持續(xù)改進(jìn),非電泳的PCR縮短了鑒定所需時間,高效、快速、準(zhǔn)確等是PCR擴(kuò)增技術(shù)的優(yōu)點(diǎn),但PCR技術(shù)存在最大的問題是容易污染,成為一種常規(guī)、有商業(yè)價值的胚胎性別鑒定方法還需進(jìn)一步研究[26]。

    2.3.3 熒光原位雜交(FISH)法 包括熒光素探針的制備、探針和靶標(biāo)DNA的變性與雜交、觀察鑒定3部分,此方法可在細(xì)胞分裂間期和分裂中期雜交,具有廣泛的應(yīng)用性[27]。侯勝奎[22]報道用FISH法鑒定分離的精子,82%的Y精子輸精后,所產(chǎn)后代80%為雄性牛。在豬胚胎性別鑒定中,將Y染色體的探針與切割胚雜交,準(zhǔn)確率為91%,后期移植仔豬生產(chǎn)的符合率為100%[28]。此方法準(zhǔn)確度高,試劑無毒害,但是鑒定需要時間較長,對試劑要求較嚴(yán)格,鑒定成本高。

    2.3.4 LAMP法 也叫環(huán)-酶恒溫擴(kuò)增法,為靶序列目標(biāo)基因上的6個區(qū)段設(shè)計4種引物及一種特殊的鏈置換型DNA聚合酶,在65 ℃恒溫條件下1 h左右,核酸的指數(shù)級擴(kuò)效率可達(dá)到109~1 010個拷貝數(shù)量級。2005年淮亞紅等用此方法對牛早期胚胎進(jìn)行性別鑒定,鑒定準(zhǔn)確率為100%,證明LAMP試劑盒具有準(zhǔn)確性、靈敏性、特異性[29]。該方法簡單快速、準(zhǔn)確靈敏,但容易受污染,需嚴(yán)格遵循操作規(guī)程[30-31]。

    3 控制受精的環(huán)境

    動物受精時的環(huán)境對于后代的性別決定有重要影響,如日糧營養(yǎng)、體液酸堿度、輸精時間等[32]。

    3.1 飼養(yǎng)類型及營養(yǎng)水平

    親代的營養(yǎng)與子代的性別有關(guān)。若母畜以采取谷物類飼料為主,則后代雌雄比例為家兔1∶1.7,犢牛1∶1.6;反之,以青綠飼料類飼料為主,后代則以雌性較多,家兔及犢牛雌雄比例均為1∶0.8[6]。在小鼠、兔和豬的臨床試驗(yàn)中已經(jīng)證實(shí)鎘元素與性別有關(guān)。將一定劑量的鎘摻入動物飼料中飼喂一段時間后,所生后代大多數(shù)是雌性。由于X精子的抵抗力較Y精子強(qiáng),體內(nèi)鎘的積累使睪丸中的曲精小管上皮細(xì)胞出血壞死,Y精子的發(fā)育和活動能力減弱,X精子有更多受精機(jī)會多,故后代雌性多[33]。

    3.2 體液酸堿度

    X精子比Y精子耐酸,酸性環(huán)境不利于Y精子的運(yùn)動,Y精子到達(dá)子宮需要的時間長,與卵子結(jié)合機(jī)會變少,故產(chǎn)生的雌性較多;Y精子比X精子耐堿性強(qiáng),Y精子在堿性環(huán)境中比X精子運(yùn)動快,與卵子結(jié)合的機(jī)會就會變高,故后代雄性較多。

    3.2.1 精氨酸 精氨酸作為稀釋液稀釋精子使精液偏酸,適量的精氨酸能提高精液的品質(zhì),但濃度較高的精氨酸對精子的生活環(huán)境會有破壞作用,精氨酸和X精子有良好的相互作用,能夠加強(qiáng)精子的存活,精氨酸的濃度為0.5%最好,有效提高了母羔率[34]。張麗等報道用生理鹽水將精氨酸稀釋成高、中、低3種濃度,分別為10%以上、5%、2.5%,輸精20~30 min后3種濃度各取1 mL注入牛陰道內(nèi),注入高濃度和低濃度的后代產(chǎn)公犢較多,中等濃度的后代產(chǎn)母犢較多[18]。用精氨酸處理過的精液,雖然可以控制后代的雌雄比例,但出生的羔羊不如沒有進(jìn)行性別控制的羔羊體質(zhì)好。趙宗勝等在處理精液時添加半支維生素B12作為增強(qiáng)劑,起到了相對較好的效果[35]。

    3.2.2 食醋液和碳酸氫鈉 張岳周報道,將40只母羊陰道用100 mL食醋液(20%)沖洗后,用稀釋2倍的羊精液輸精,產(chǎn)羔44只,其中31只母羔,母羔率達(dá)70.45%。27只母羊陰道用100 mL碳酸氫鈉(2.5%)沖洗,此時讓羊體呈前高后低站立10~15 min,沖洗液流盡后每只羊輸入0.2 mL精液,產(chǎn)羔29只,其中18只公羔,公羔率達(dá)62.07%[5]。

    3.2.3 DATONG-01液 利用pH值為6.88的DATONG-01液,在人工輸精前20~30 min注射0.5 mL到子宮頸0.5~1 cm處,X精子在這種環(huán)境下活躍,Y精子受到抑制,后代雌性增多,顯著高于對照組(不作任何處理)[36]。而且操作簡單、成本低,便于在生產(chǎn)單位推廣應(yīng)用,對提高養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟(jì)效益,促進(jìn)畜牧業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展具有重大意義。

    3.2.4 葡萄糖 葡萄糖在胚胎發(fā)育過程中有重要作用。經(jīng)卵母細(xì)胞體外成熟(IVM)和體外受精(IVF)技術(shù)體外生產(chǎn)牛胚胎時,在培養(yǎng)液中添加葡萄糖,受精卵發(fā)育到囊胚期時檢測發(fā)現(xiàn),雄性胚胎多且發(fā)育快于雌性[37]。李景云等人報道在人工輸精前30 min靜脈注射100 mL濃度為50%的葡萄糖,后代的母羔率達(dá)86.67%,比第一組(25%葡萄糖100 mL)和第二組(5%碳酸氫鈉100 mL)效果都好[38]。

    3.3 輸精時間

    施巧婷等報道,受精時卵子的成熟狀態(tài)對胚胎性別有很大的影響,在卵子徹底成熟時受精,雄性胚胎多于雌性胚胎,并闡明了性別比例與輸精時間相關(guān),在排卵前5 h給綿羊輸精,后代多為母羔;在排卵后5 h輸精,后代多為公羔[28]。

    綜上所述,X、Y精子分離和胚胎性別鑒定的方法存在重復(fù)性差、儀器昂貴、操作技術(shù)要求高、準(zhǔn)確率低、耗時長、對精子或者胚胎損傷大等問題。而采取動物排卵前或后5 h輸精,或者輸精前向動物子宮頸注入精氨酸、食醋液、DATONG-01液、葡萄糖等方法切實(shí)可行,這類通過改變外界環(huán)境控制后代性別的方法具有效果好、方便快捷、對動物損傷小的特點(diǎn),可以在生產(chǎn)實(shí)踐中推廣應(yīng)用。

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