兔脂肪干細(xì)胞（ADSCs）與聚羥基乙酸/殼聚糖（PLGA/CS）支架材料生物相容性研究

李春波 王 紅 陳增淦 陳統(tǒng)一 張 峰 周建平 崔 磊 尹靜波

（1復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院骨科，2普外科 上海 200032；3上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整形外科 上海 200011；4上海大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院高分子材料系 上海 200444）

兔脂肪干細(xì)胞（ADSCs）與聚羥基乙酸/殼聚糖（PLGA/CS）支架材料生物相容性研究

李春波1▲王 紅2▲陳增淦1△陳統(tǒng)一1張 峰1周建平1崔 磊3尹靜波4

（1復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院骨科，2普外科 上海 200032；3上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整形外科 上海 200011；4上海大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院高分子材料系 上海 200444）

目的探討兔脂肪來源干細(xì)胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）作為種子細(xì)胞復(fù)合新型聚羥基乙酸（polylactic-co-glycolic acid，PLGA）/殼聚糖（chitosan，CS）支架材料的生物相容性，為進(jìn)一步構(gòu)建組織工程化脂肪組織提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法取雄性新西蘭大白兔腹股溝脂肪組織，Ⅰ型膠原酶消化分離出ADSCs進(jìn)行培養(yǎng)，貼壁細(xì)胞至3～5代，評(píng)價(jià)其多向分化能力。將干細(xì)胞收集重懸后，以l×107/mL的密度接種于多孔PLGA/CS支架，形成細(xì)胞-支架材料復(fù)合物。培養(yǎng)7天后，掃描電子顯微鏡觀察細(xì)胞在支架材料上的黏附生長(zhǎng)和基質(zhì)分泌情況，評(píng)價(jià)細(xì)胞與支架材料的生物相容性；Dil熒光標(biāo)記檢測(cè)細(xì)胞在支架材料上的分布；Hochest 33258檢測(cè)細(xì)胞在支架上的生長(zhǎng)情況。接種1和7天后，分別對(duì)細(xì)胞-材料復(fù)合物行Annexin V/PI雙染色法檢測(cè)材料對(duì)細(xì)胞的毒性作用。用成脂誘導(dǎo)條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化ADSCs及ADSCs支架材料復(fù)合物，7天后，尼羅紅熒光染色液檢測(cè)ADSCs在不同環(huán)境下的成脂分化能力。結(jié)果原代培養(yǎng)的ADSCs呈成纖維細(xì)胞樣外觀，在相應(yīng)誘導(dǎo)條件下能夠分化為脂肪細(xì)胞和骨細(xì)胞。細(xì)胞接種于PLGA/CS支架材料上第8天分裂增殖達(dá)到高峰，掃描電子顯微鏡下提示ADSCs在支架表面貼附生長(zhǎng)良好，并向孔隙內(nèi)壁充分延伸，細(xì)胞周圍形成豐富的基質(zhì)成分。活死雙染結(jié)合共聚焦顯微鏡顯示材料對(duì)細(xì)胞活性無影響，尼羅紅染色可見成脂誘導(dǎo)后的ADSCs細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有紅色脂滴顆粒形成。結(jié)論多孔PLGA/CS支架與兔ADSCs具有良好的生物相容性，可作為構(gòu)建組織工程脂肪組織的支架材料。

脂肪干細(xì)胞（ADSCs）；生物相容性；組織工程；聚羥基乙醇（PLGA）；殼聚糖（CS）

*This work was supported by the Key Project of Science and Technology Commission of Shanghai Municipality（10411953900）.

組織工程的核心是形成細(xì)胞-支架材料復(fù)合物來重建缺損的組織，選用何種干細(xì)胞及支架材料仍是需要解決的重要問題。脂肪源性干細(xì)胞（adiposederived stem cells，ADSCs）是一類存在于脂肪組織基質(zhì)中、具有極強(qiáng)的自我更新能力和多向分化潛能的干細(xì)胞，因而被廣泛應(yīng)用于組織修復(fù)和細(xì)胞替代治療［1-3］。ADSCs具有來源豐富、取材方便及對(duì)機(jī)體損傷小等優(yōu)勢(shì)，已成為脂肪組織工程理想的種子細(xì)胞［4-5］。研究已經(jīng)證實(shí)單一材料很難滿足組織工程的需要，通過合適的方法將兩種或多種類型的材料組合起來，可以得到性能更加優(yōu)良的復(fù)合支架材料［6］。聚羥基乙酸（polylactic-co-glycolic acid，PLGA）/殼聚糖（chitosan，CS）是由水溶性的PLGA的羧基和CS的氨基相互交聯(lián)合成的一種高分子材料，具有良好的可降解性和生物相容性，在組織工程領(lǐng)域具有廣闊的前景［7］。本實(shí)驗(yàn)通過體外培養(yǎng)兔ADSCs，觀察其與多孔PLGA/CS支架復(fù)合材料的生物相容性，為進(jìn)一步構(gòu)建脂肪組織提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

材料和方法

實(shí)驗(yàn)試劑及儀器DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)Hyclone公司）；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS，澳大利亞JRH公司）；L-谷氨酰胺300g/mL，胰蛋白酶（上海實(shí)生生物技術(shù)有限公司）；氯仿，抗壞血酸50g/mL，青霉素0.0625g/L，鏈霉素100g/L，Ⅰ型膠原酶（美國(guó)Sigma公司）；Dil染液（美國(guó)Invitrogen公司）；PLGA/CS由上海大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院提供。

兔ADSCs的分離培養(yǎng)雄性新西蘭大白兔4只（復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院實(shí)驗(yàn)研究中心），體重1.5～2kg。將兔麻醉后于無菌條件下取腹股溝處皮下2.0～3.0mL脂肪組織，剔除血管及筋膜，PBS沖洗3次。然后剪成1mm×1mm×1mm的脂肪顆粒，加入等體積、含量為0.075％的I型膠原酶，37℃恒溫振蕩消化1h。取等體積的完全培養(yǎng)基（含低糖DMEM、10％FBS、100g/L鏈霉素、0.0625g/L青霉素）中和后，2 000r/min（半徑15cm）離心10min，去除雜質(zhì)及上清，加入完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，置于37℃、5％CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行單層細(xì)胞培養(yǎng)。24h后更換1次培養(yǎng)基，以后每3天換液1次。7～9天后細(xì)胞生長(zhǎng)融合達(dá)80％～90％，經(jīng)0.5g/L胰酶-EDTA消化，按1∶3進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

兔ADSCs的多向分化潛能將第3代兔ADSCs以1×104/cm2的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)24h待細(xì)胞穩(wěn)定貼壁后，更換為成脂誘導(dǎo)液（DMEM培養(yǎng)液中含1×10-6mol/L地塞米松、10mg/L胰島素、0.5mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤和0.02mmol/L吲哚美辛）及成骨誘導(dǎo)液（DMEM培養(yǎng)液中含1.0×10-7mol/L地塞米松、10mmol/Lβ-磷酸甘油鈉和50mg/L左旋維生素C）［1］。每3天更換1次培養(yǎng)液，分別于培養(yǎng)1周和3周后行油紅O及茜素紅染色，倒置顯微鏡下觀察并拍照。

多孔PLGA/CS支架材料的制備將相對(duì)分子質(zhì)量為1×105的PLGA均勻溶解于NaOH溶液（pH=9）中，隨后加入相對(duì)分子質(zhì)量為4×104的CS粉末。將混合物充分?jǐn)嚢?h（800r/min），使CS粉末均勻分布在PLGA溶液。加入醋酸溶液調(diào)整至pH=4.5，利用靜電反應(yīng)技術(shù)使CS粉末完全溶解。經(jīng)-90℃冷凍和干燥后，即獲得多孔的PLGA/CS材料。裁剪至合適大小備用，用體積分?jǐn)?shù)2.5％戊二醛固定過夜，乙醇梯度脫水，臨界點(diǎn)干燥，噴金，掃描電子顯微鏡下觀察支架材料的微細(xì)結(jié)構(gòu)。

細(xì)胞-支架材料復(fù)合物的制備將第3～5代兔ADSCs用0.25％胰蛋白酶及0.02％EDTA消化后，收集在50mL離心管中，1 500r/min（半徑15cm）離心5min，棄上清液。加入含10％FBS的DMEM培養(yǎng)液，計(jì)數(shù)，配制成1×107/mL細(xì)胞懸液，用微量移液槍將細(xì)胞接種于經(jīng)過滅菌的支架材料。置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h后，添加培養(yǎng)基；24h后，把細(xì)胞-材料復(fù)合物移至6孔板，留待后續(xù)檢測(cè)。

掃描電子顯微鏡下觀察兔ADSCs的分布及細(xì)胞外基質(zhì)的分泌將ADSCs接種于PLGA/CS支架材料7天后，PBS沖洗2次，體積分?jǐn)?shù)2.5％戊二醛固定過夜，乙醇梯度脫水，臨界點(diǎn)干燥，噴金，掃描電子顯微鏡下觀察支架表面細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，了解材料與ADSCs的相容性及黏附情況。

兔ADSCs在PLGA/CS支架材料上的增殖情況分別于接種后第1～12天對(duì)支架材料上生長(zhǎng)的兔ADSCs進(jìn)行計(jì)數(shù)。將經(jīng)成脂誘導(dǎo)的ADSCs-PLGA/CS復(fù)合物置于EP管中，將蛋白酶K（0.5g/L）溶液1mL加入EP管中裂解細(xì)胞，56℃過夜消化。12 000r/min（半徑15cm）離心15min，吸出40μL上清液移入96孔板，隨后加入Hochest 33258染液160μL，混合均勻，于37℃恒溫箱里避光孵育20min，以酶標(biāo)儀檢測(cè)360nm處的熒光強(qiáng)度（激發(fā)光波長(zhǎng)為465nm）。未經(jīng)過成脂誘導(dǎo)的ADSCs-PLGA/CS復(fù)合物作為對(duì)照組。用同樣方法檢測(cè)未接種ADSCs的PLGA/CS材料在360nm處的熒光強(qiáng)度，測(cè)定樣本熒光值=復(fù)合物熒光值-材料熒光值。確定所測(cè)樣本的DNA熒光強(qiáng)度，繪制標(biāo)準(zhǔn)增殖曲線。

Dil熒光標(biāo)記兔ADSCs在PLGA/CS支架材料上的增殖情況收集消化后的ADSCs，加入預(yù)先由無血清DMEM培養(yǎng)液稀釋后的Dil染液（5μg/mL），置于培養(yǎng)箱中孵育15min后，1 500r/min（半徑15cm）離心5min，棄去染液，以新鮮生長(zhǎng)培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將標(biāo)記好的細(xì)胞接種于PLGA/CS材料，于第1、7天在共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞在支架材料上的生長(zhǎng)情況。

Annexin V/PI雙染色法檢測(cè)PLGA/CS支架材料對(duì)兔ADSCs的毒性作用將細(xì)胞-支架材料復(fù)合物培養(yǎng)在培養(yǎng)箱中1、7天后，按熒光染色試劑盒的說明，將熒光試劑加入細(xì)胞-材料復(fù)合體，于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中染色15min。共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞的存活情況：活細(xì)胞呈綠色熒光，死細(xì)胞呈紅色熒光。

尼羅紅染色評(píng)價(jià)ADSCs在2維和3維環(huán)境下的成脂分化將取傳代培養(yǎng)3～5代兔ADSCs和ADSCs-PLGA/CS復(fù)合物加入到成脂誘導(dǎo)液中進(jìn)行培養(yǎng)。成脂誘導(dǎo)2周后，棄去培養(yǎng)基，PBS清洗3遍，質(zhì)量分?jǐn)?shù)4％的中性多聚甲醛固定30min。將尼羅紅粉末溶于DMSO溶液，配成濃度為1mg/mL的儲(chǔ)存液，-20℃保存；再將尼羅紅儲(chǔ)存液溶于雙蒸水中，配成1μg/mL的工作液。將細(xì)胞置于尼羅紅染液中常溫避光孵育10min，棄去染液，雙蒸水清洗，倒置共聚焦顯微鏡下觀察并拍照（吸收光/激發(fā)光=552nm/636nm）［8］。

結(jié)果

兔ADSCs的形態(tài)觀察ADSCs培養(yǎng)24h后，可見少量散在的貼壁細(xì)胞，以長(zhǎng)梭形細(xì)胞為主，部分呈三角形或不規(guī)則形。72h后，可見較多的梭形貼壁細(xì)胞，生長(zhǎng)速度快，后增生為形態(tài)相對(duì)均一穩(wěn)定的成纖維樣梭形細(xì)胞（圖1A），7天后細(xì)胞融合至80％～90％。第3代ADSCs為長(zhǎng)梭形，形態(tài)均一，增殖速度較快（圖1B）。ADSCs經(jīng)成脂誘導(dǎo)1周后，可見細(xì)胞由長(zhǎng)梭形變?yōu)闄E圓形，經(jīng)油紅O染色可見細(xì)胞內(nèi)大量紅色脂滴形成（圖1C）。ADSCs在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)3周后，可見細(xì)胞呈多層生長(zhǎng)，經(jīng)茜素紅染色可見細(xì)胞周圍基質(zhì)出現(xiàn)紅色鈣鹽沉積（圖1D）。

兔ADSCs在PLGA/CS支架材料上的分布將ADSCs接種到PLGA/CS支架材料上復(fù)合培養(yǎng)，未接種ADSCs作為對(duì)照組（圖2A）。掃描電子顯微鏡可見PLGA/CS材料表面呈多孔狀，孔徑約100～300μm（圖2B、C）。兔ADSCs復(fù)合PLGA/CS培養(yǎng)7天后，可見細(xì)胞緊密附著于材料表面及孔壁，黏附生長(zhǎng)，胞體呈高度鋪展，相互交聯(lián)并堆積復(fù)層生長(zhǎng)，增殖狀態(tài)良好，覆蓋材料表面，表明ADSCs和PLGA/CS支架材料有較好的生物相容性（圖2D、E、F）。

圖1 ADSCs的形態(tài)特點(diǎn)及多向分化能力Fig 1 Morphological character and multi-directional differentiation of ADSCs

圖2 掃描電子顯微鏡下ADSCs在PLGA/CS支架材料上的生長(zhǎng)及黏附情況Fig 2 Growth and adhesion of ADSCs on PLGA/CS scaffold under SEM

兔ADSCs在PLGA/CS支架材料上的增殖情況將ADSCs-PLGA/CS復(fù)合培養(yǎng)后進(jìn)行Hochest 33258檢測(cè)，細(xì)胞曲線呈S形，培養(yǎng)72h內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)較慢，第3天后細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，第8天達(dá)到緩慢生長(zhǎng)期，第8～12天上升緩慢，說明細(xì)胞基本布滿支架材料；對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線與實(shí)驗(yàn)組相同（圖3）。說明PLGA/CS支架材料與ADSCs具有良好的生物相容性。

圖3 ADSCs在PLGA/CS支架材料上的增殖情況Fig 3 Proliferation curve of ADSCs on PLGA/CS scaffold

Dil標(biāo)記的兔ADSCs在PLGA/CS支架材料上的黏附情況Dil是一種親脂性熒光染料，能與細(xì)胞膜結(jié)合以標(biāo)記細(xì)胞，不影響細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。Dil熒光標(biāo)記結(jié)果顯示：細(xì)胞在支架材料上黏附，并沿纖維方向延伸生長(zhǎng)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞數(shù)量明顯增多，至培養(yǎng)第7天細(xì)胞已經(jīng)布滿整個(gè)纖維支架表面，呈網(wǎng)格狀分布（圖4）。

圖4 共聚焦顯微鏡下ADSCs在PLGA/CS支架材料上的黏附情況（Dil熒光標(biāo)記）Fig 4 Adhesion of ADSCs on PLGA/CSscaffold under confocal microscopy（with Dilinfluorescence fluid）

Annexin V/PI雙染色法檢測(cè)兔ADSCs對(duì)PLGA/CS支架材料的毒性作用Annexin V是一種Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與位于細(xì)胞膜的磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）高親和力特異性結(jié)合。碘化丙啶（propidine iodide，PI）是一種核酸染料，它不能透過活細(xì)胞的細(xì)胞膜，但能夠透過死細(xì)胞的細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染。將Annexin V與PI匹配使用，共聚焦顯微鏡下拍照可以區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞：活細(xì)胞呈綠色熒光，死細(xì)胞呈紅色熒光。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，呈綠色熒光的細(xì)胞數(shù)量明顯增多，至培養(yǎng)第7天細(xì)胞分布于整個(gè)支架材料，并呈簇聚集。呈紅色熒光的死細(xì)胞數(shù)量并未見明顯增加（圖5）。

圖5 共聚焦顯微鏡下檢測(cè)PLGA/CS支架材料對(duì)兔ADSCs的毒性作用（Annexin V/PI熒光染色）Fig 5 Toxicity of PLGA/CSscaffold to ADSCs under confocal microscopy（with Annexin V/PI fluorescence fluid）

尼羅紅染色評(píng)價(jià)ADSCs在2維及3維環(huán)境下的成脂分化ADSCs和ADSCs-PLGA/CS支架材料復(fù)合物經(jīng)成脂誘導(dǎo)液作用7天后，尼羅紅染色，熒光顯微鏡下可見多個(gè)細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)紅色熒光的脂肪滴，細(xì)胞核顯示不清。在2維培養(yǎng)條件下，可見細(xì)胞類似于第3代ADSCs分布（圖6A），細(xì)胞內(nèi)形成大量呈紅色熒光的脂滴（圖6B）。在3維培養(yǎng)條件下，細(xì)胞沿著材料的孔徑呈網(wǎng)狀分布（圖6C），細(xì)胞內(nèi)形成大量呈紅色熒光的脂滴（圖6D）。

討論

種子細(xì)胞在組織工程領(lǐng)域的應(yīng)用一直以來都是研究熱點(diǎn)。自2001年Zu K等［1］發(fā)現(xiàn)ADSCs以來，ADSCs因其具有取材方便、獲取率高、對(duì)供區(qū)組織損傷小、體外擴(kuò)增迅速以及多向分化潛能等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于組織工程和再生醫(yī)學(xué)中［5］。目前的研究已經(jīng)證實(shí)在不同誘導(dǎo)條件下，ADSCs可以向脂肪、軟骨、骨等細(xì)胞系分化，因此是一種具有多向分化潛能的干細(xì)胞，為組織工程領(lǐng)域的研究提供了新的方向［9-11］。本實(shí)驗(yàn)所涉及的分離培養(yǎng)ADSCs的方法主要參照Cardozo等［12］的研究。兔腹股溝區(qū)皮下脂肪組織含有較豐富的干細(xì)胞，在取材時(shí)剔除血管及筋膜并用PBS反復(fù)沖洗，利用貼壁篩選法去除血細(xì)胞成分并分離出ADSCs。分離培養(yǎng)的ADSCs具有很好的增殖能力，與成脂及成骨誘導(dǎo)液作用后可向脂肪細(xì)胞及骨細(xì)胞分化，油紅O及茜素紅染色進(jìn)一步證實(shí)了其多向分化的能力。

圖6 尼羅紅染色評(píng)價(jià)ADSCs與成脂誘導(dǎo)液作用7天后的成脂分化情況Fig 6 Adipogenic differentiation of ADSCs cultured in adipogenic inducing medium for 7 days was evaluated by Nile red staining

研究證實(shí)，利用組織工程方法構(gòu)建脂肪組織，除了具有足夠數(shù)量的種子細(xì)胞外，還要有一定的3維空間的生物可降解支架。理想的生物材料應(yīng)具備：（1）良好的生物相容性，不僅能與接種的細(xì)胞相容和還能與回植體內(nèi)周圍其他組織相融合；（2）可控的生物降解性，降解后的代謝物對(duì)機(jī)體無損害、無毒性；（3）一定的機(jī)械強(qiáng)度和可塑性；（4）立體多孔的結(jié)構(gòu)；（5）半滲透性，以利于小分子的交換。目前用于組織工程的支架材料來源有天然生物材料和人工合成材料。常用的人工材料包括：活性陶瓷羥、基磷灰石、磷酸三鈣、聚乳酸、聚乙醇酸、PLGA共聚物、聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯以及某些金屬材料等，天然生物材料主要包括：膠原、幾丁質(zhì)、葡聚糖、硫酸軟骨素、纖維蛋白凝膠、珊瑚、滅活動(dòng)物骨等［13］。PLGA是由聚乳酸（polylactic acid，PLA）和聚羥基乙酸（polyglycolic acid，PGA）形成的共聚物，具有良好的生物相容性和力學(xué)性能，對(duì)機(jī)體無毒性及免疫原性，其降解產(chǎn)物是機(jī)體正常的代謝成分。PLGA的結(jié)構(gòu)和親/疏水性及降解率可以通過PLA和PGA的比列進(jìn)行調(diào)節(jié)［14］。PLGA表面活性和機(jī)械性能良好，能促進(jìn)種子細(xì)胞的黏附、增殖和分化，同時(shí)可控的降解速率同步于組織形成速率，因而有利于組織的再生與修復(fù)。近年來，PLGA已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用于軟骨、骨、脂肪組織工程及藥物緩釋系統(tǒng)等領(lǐng)域［15］。但是PLGA具有較高的水溶性，不能形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)無法為細(xì)胞的黏附和增殖提供合適的微環(huán)境。CS是甲殼素脫乙?；蟮漠a(chǎn)物，無毒，無氣味，可吸收，具有良好的生物相容性和促進(jìn)細(xì)胞黏附和增殖的優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)材料領(lǐng)域［16-18］。CS的游離羥基和PLGA的羧基發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，使支架強(qiáng)度提高。殼聚糖可以在PLGA表面形成一層膜性結(jié)構(gòu)，有效彌補(bǔ)單純PLGA支架材料易溶性和穩(wěn)定性不足等問題［7］。研究表明，聯(lián)合CS的穩(wěn)定性及PLGA的生物活性制備的復(fù)合支架，比單一成分支架具有更好的生物和機(jī)械性能。

本研究我們選用孔徑為100～300μm，孔隙率為90％、PLGA∶CS為1∶1的PLGA/CS作為支架材料［6］，觀察其與兔ADSCs復(fù)合情況，并進(jìn)一步探討其是否可作為脂肪組織工程的支架材料。電子顯微鏡下發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在支架表面和支架孔壁上能很好地黏附、伸展和生長(zhǎng)。ADSCs不僅能黏附在材料表面，還能生長(zhǎng)進(jìn)入材料的空隙內(nèi)，說明PLGA/CS支架為ADSCs提供了良好的3維空間，能容納更多數(shù)量的細(xì)胞。Dil熒光標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果顯示，細(xì)胞在支架上黏附，并沿纖維方向延伸生長(zhǎng)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞數(shù)量明顯增多。Hochest 33258檢測(cè)兔ADSCs在多孔PLGA/CS上的生長(zhǎng)曲線，結(jié)果顯示以1×103/mL接種于材料上的細(xì)胞生長(zhǎng)良好，植入8天后細(xì)胞數(shù)量達(dá)到最大值。Annexin V/PI雙染色法提示支架材料對(duì)細(xì)胞的活性無毒性作用，且不影響細(xì)胞的增殖。實(shí)驗(yàn)證實(shí)PLGA/CS具有良好的生物相容性，能夠?yàn)榻M織工程種子細(xì)胞的生長(zhǎng)提供適宜的3維空間。當(dāng)把細(xì)胞-支架材料復(fù)合物植入體內(nèi)時(shí)，支架材料逐漸降解，ADSCs逐漸分化為脂肪細(xì)胞，并分泌特定的細(xì)胞外基質(zhì)，最后構(gòu)成穩(wěn)定的疏松網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

ADSCs經(jīng)過成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)后，胞內(nèi)有大量的脂滴形成。使用油紅O染色法進(jìn)行形態(tài)學(xué)檢測(cè)，其原理是油紅O可以特異性使甘油三酯等中性脂肪著色。但是對(duì)于三維支架材料上ADSCs的成脂誘導(dǎo)形態(tài)檢測(cè)，此種方法具有局限性。尼羅紅染色劑是一種親脂性的惡嗪類熒光染料，與脂類物質(zhì)（包括臘酯和三酰甘油）以及各種脂肪酸結(jié)合后，在激發(fā)波長(zhǎng)485nm處顯示為紅色［8］。在本研究中，細(xì)胞-支架材料復(fù)合物經(jīng)過成脂誘導(dǎo)液作用7天后，加入尼羅紅染液，脂滴顯示紅色。此方法可以直觀地觀察到成脂誘導(dǎo)的ADSCs形成脂滴的形態(tài)。

在應(yīng)用組織工程方法重建缺損的組織時(shí)，移植組織在體內(nèi)需維持較長(zhǎng)時(shí)間是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。因此，支架材料降解的時(shí)間必須要和重建組織生成的時(shí)間相適應(yīng)。Patrick等［19］研究發(fā)現(xiàn)，將脂肪前體細(xì)胞復(fù)合到PLGA支架材料上，再回植入大鼠體內(nèi)后2個(gè)月，形成脂肪組織數(shù)量最多；隨后逐漸減少；5個(gè)月后，生成的脂肪組織完全消失。因此，為了構(gòu)建合適的組織工程脂肪組織，支架材料的降解時(shí)間必須達(dá)到2～5個(gè)月。研究證實(shí)，通過調(diào)整PLGA與CS的比例，可以改變PLGA/CS支架材料的降解率［6］。為了獲得合適的支架材料，進(jìn)一步研究需要通過調(diào)整PLGA和CS的比率來改變支架材料的降解率，使其滿足不同類型組織的生成。

本研究成功分離了兔ADSCs，并驗(yàn)證了其向成脂、成骨分化的能力。將兔ADSCs種植在3維多孔PLGA/CS支架材料上，顯示了良好的生物相容性，PLGA/CS對(duì)兔ADSCs的黏附、增生、分化和分泌功能均無明顯影響。研究證實(shí)，PLGA/CS可以作為構(gòu)建組織工程的支架材料，但是體外實(shí)驗(yàn)尚不能完全反映該支架材料長(zhǎng)期植入體內(nèi)可能發(fā)生的生物學(xué)效應(yīng)，此生物材料是否適合機(jī)體組織工程脂肪組織的構(gòu)建，還有待進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)予以證實(shí)。

［1］Zuk PA，Zhu M，Mizuno H，et al.Multilineage cells from human adipose tissue：implications for cell-based therapies［J］.Ttssue Eng，2001，7（2）：211-228.

［2］朱艷霞，宋克東，文鵬飛，等.體外培養(yǎng)脂肪組織來源干細(xì)胞與膠原/殼聚糖復(fù)合支架的親和性［J］.中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2007，11（31）：6155-6160.

［3］Xu J，Chen Y，Yue Y，et al.Reconstruction of epidural fat with engineered adipose tissue from adipose derived stem cells and PLGA in the rabbit dorsal laminectomy model［J］.Btomatertals，2012，33（29）：6965-6973.

［4］Cho SW，Kim SS，Rhie JW，et al.Engineering of volumestable adipose tissues［J］.Btomatertals，2005，26（17）：3577-3585.

［5］Strem BM，Hicok KC，Zhu M，et al.Multipotential differentiation of adipose tissue-derived stem cells［J］.Keto J Med，2005，54（3）：132-141.

［6］Cao B，Yin J，Yan S，et al.Porous scaffolds based on cross-linking of poly（L-glutamic acid）［J］.Macromol Btosct，2011，11（3）：427-434.

［7］Wang W，Cao B，Cui L，et al.Adipose tissue engineering with human adipose tissue-derived adult stem cells and a novel porous scaffold［J］.J Btomed Mater Res B Appl Btomater，2013，101（1）：68-75.

［8］Venugopal B，F(xiàn)ernandez FB，Babu SS.et al.Adipogenesis on biphasic calcium phosphate using rat adipose-derived mesenchymal stem cells：tn vttroandtn vtvo［J］.J Btomed Mater Res A，2012，100（6）：1427-1437.

［9］Huang JI，Zuk PA，Jones NF，et al.Chondrogenic potential of multipotential cells from human adipose tissue［J］.Plast Reconstr Surg，2004，113（2）：585-594.

［10］Bunnell BA，F(xiàn)laat M，Gagliardi C，et al.Adipose-derived stem cells：isolation，expansion and differentiation［J］.Methods，2008，45（2）：115-120.

［11］Gao S，Zhao P，Lin C，et al.Differentiation of humanadipose derived stem cells into neuron-like cells which are compatible with photocurable three-dimensional scaffolds［J］.Ttssue Eng Part A，2014，20（7-8）：1271-1284.

［12］Cardozo AJ，Gomez DE，Argibay PF.Neurogenic differentiation of human adipose-derived stem cells：relevance of different signaling molecules，transcription factors，and key marker genes［J］.Gene，2012，511（2）：427-436.

［13］Kim HJ，Park SH，Durham J，et al.In vttrochondrogenic differentiation of human adipose-derived stem cells with silk scaffolds［J］.J Ttssue Eng，2012，3（1）：2041731412466405.

［14］戚超，楊志明，黃富國(guó)，等.體外構(gòu)建與體內(nèi)構(gòu)建組織工程的比較研究［J］.中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2004，21（7）：857-859.

［15］Boquest AC，Shahdadfar A，Brinchmann JE，et al.Isolation of stromal stem cells from human adipose tissue［J］.Methods Mol Btol，2006，325：35-46.

［16］Shi C，Zhu Y，Ran X，et al.Therapeutic potential of chitosan and its derivatives in regenerative medicine［J］.J Surg Res，2006，133（2）：185-192.

［17］鮑慧婧，鄒俊，尹碩，等.脂肪干細(xì)胞構(gòu)建組織工程化角膜機(jī)制組織［J］.復(fù)旦學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2010，37（6），631-636.

［18］Chen A，Hou C，Bao JL，et al.Antibiotic loaded chitosan bar：An tn vttro，tn vtvostudy of a possible treatment for osteomyelitis［J］.Cltn Orthop Relat Res，1999，（366）：239-247.

［19］Patrick CW Jr，Zheng B，Johnston C，et al.Long-term implantation of preadipocyte-seeded PLGA scaffolds［J］.Ttssue Eng，2002，8（2）：283-293.

Biocompatibility of rabbit adipose-derived stem cells（ADSCs）with porous polylactic-co-glycolic acid（PLGA）and chitosan scaffold（CS）

LI Chun-bo1▲，WANG Hong2▲，CHEN Zeng-gan1△，CHEN Tong-yi1，
ZHANG Feng1，ZHOU Jian-ping1，CUI Lei3，YIN Jing-bo4
（1Department of Orthopedtcs，2Department of General Surgery，Zhongshan Hospttal，F(xiàn)udan Untverstty，Shanghat200032，Chtna；3Department of Plasttcs，Shanghat Ntnth People's Hospttal，School of Medtctne，Shanghat Jtaotong Untverstty，Shanghat200011，Chtna；4Department of Polymer Matertal，School of Matertals Sctence and Engtneertng，Shanghat Untverstty，Shanghat200444，Chtna）

ObjectiveTo investigate the biocompatibility of rabbit adipose-derived stem cells（ADSCs）and polylactic-co-glycolic acid（PLGA）/chitosan（CS）scaffold and to provide experiment basis for building tissue-engineered adipose tissue.MethodsADSCs were isolated from subcutaneousadipose tissue in groin area of New Zealand white rabbit with the method of enzymatic digestion.The cells were cultured and passaged to 3-5 generation and its differentiation ability was evaluated.After 3-5 generation ADSCs were harvested，re-suspended with a density of 1×107/mL and replanted into PLGA/CS scaffold，scanning electron microscope was used to reveal the microstructure of PLGA/CS and the growth of ADSCs on PLGA/CS scaffold 1 and 7 days after seeding for the evaluation of biocompatibility between ADSCs and PLGA/CS scaffold.The distribution of ADSCs on PLGA/CS scaffold appended with adipogenic inducing medium or basic culture medium was evaluated with Dil fluorescence and confocal microscopy.The proliferation of ADSCs on PLGA/CS scaffold appended with adipogenic inducing medium or basic culture medium was evaluated with hochest33258.At 1 and 7 days post-seeding，the toxicity of PLGA/CS scaffold to ADSCs was assessed by Annexin V/PI influorescence fluid.ADSCs and ADSCs-PLGA/CS complex were cultivated in adipogenic inducing medium for 7 days and the differentiated cells were identified by Nile red stanning.ResultsPrimarily cultured rabbit ADSCs presented fibroblast-like appearance and ADSCs cultured in adipogenic and ostogenic medium could differentiate into adipose cell and bone cells.The proliferation of cells on PLGA/CS scaffold with adipogenic inducing medium or basic culture medium went plateau phase on the 8 day.Scanning electron microscopy（SEM）showed that ADSCs could grow well on the PLGA/CS scaffold and abundant extracelluar matrix（ECM）both on the surface and interior pore of scaffold.Annexin V/PI influorescence staining and confocal microscopy demonstrated that the PLGA/CS scaffold could not affect the activity of ADSCs post-seeding.An amount of lipid droplet within cytoplasm of cells on the PLGA/CS scaffold was revealed by Nile red staining.ConclusionsThe porous PLGA/CS scaffold and rabbit ADSCs has excellent biocompatibility，which could be used as a tissue engineered scaffold for building adipose tissue.

adipose-derived stem cells（ADSCs）；biocompatibility；tissue engineer；polylacticco-glycolic acid（PLGA）；chitosan（CS）

R 318.08

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2014.05.007

上海市科委重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目（10411953900）

▲Co-frist authors

△Corresponding author E-mail：chen.zenggan@zs-hospital.sh.cn

2013-12-24；編輯：段佳）