裸大鼠人乳腺癌皮下移植瘤模型的建立和評(píng)價(jià)

賈羅琦 王 超 程明軍 孫 建

（1復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院研究所，2病理科，3乳腺外科 上海 200011）

裸大鼠人乳腺癌皮下移植瘤模型的建立和評(píng)價(jià)

賈羅琦1▲王 超2▲程明軍1孫 建3△

（1復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院研究所，2病理科，3乳腺外科 上海 200011）

目的采用細(xì)胞懸液種植法和組織塊移植法建立裸大鼠人乳腺癌皮下移植瘤模型并觀察其生物學(xué)特性。方法體外培養(yǎng)人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231，注射于10只同種雌性裸大鼠皮下，2周后處死2只成瘤裸大鼠，將皮下瘤修剪成2mm3的組織塊移植入10只同種雌性裸大鼠皮下。4周后將所有裸大鼠處死，取出皮下瘤。通過(guò)巨檢、鏡檢、免疫組化等觀察腫瘤的生物學(xué)特性。結(jié)果采用細(xì)胞懸液種植法的10只雌性裸大鼠皮下均成瘤，采用組織塊移植法的10只雌性裸大鼠中8只皮下成瘤。兩種方法的成瘤速度基本相似。HE染色和免疫組化染色證實(shí)兩種方法建立的裸大鼠人乳腺癌模型的特性基本一致。結(jié)論采用細(xì)胞懸液種植法和組織塊移植法均能成功建立裸大鼠人乳腺癌模型，為乳腺癌的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和新型治療等研究提供了較理想的動(dòng)物模型。

乳腺癌；裸大鼠；動(dòng)物模型

*This work was support by Shanghai Health Bureau Foundation（2010049），and Shanghai Health Bureau Foundation for Youth（2010Y163）.

乳腺癌發(fā)病率居女性惡性腫瘤的第1位，全世界每年約有120多萬(wàn)女性被診斷為乳腺癌［1-2］，我國(guó)乳腺癌發(fā)病率和死亡率也呈明顯上升趨勢(shì)［3］。國(guó)內(nèi)外廣泛采用乳腺癌動(dòng)物模型進(jìn)行基礎(chǔ)和臨床研究。以往多選用裸小鼠腫瘤模型，但裸小鼠個(gè)體小，成瘤后所獲腫瘤組織太少，難以進(jìn)行手術(shù)等操作。為了更好地開展乳腺癌研究，我們參照裸小鼠人乳腺癌模型構(gòu)建方法，建立了裸大鼠人乳腺癌乳腺脂肪墊原位移植模型，并評(píng)價(jià)其生物學(xué)特性。

材料和方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物20只健康雌性裸大鼠（rnu/rnu），4～5周齡，體重55～70g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。隨機(jī)分為2組：細(xì)胞懸液種植（cell suspension implantation，CSI）組和組織塊移植（tumor mass transplantation，TMT）組，每組各10只。裸大鼠飼養(yǎng)于復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院SPF級(jí)動(dòng)物房，飼以高壓滅菌水和飼料，飼養(yǎng)室相對(duì)濕度55％±10％，溫度（22±2）℃，光照12h，明暗交替。

細(xì)胞株人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231，經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)驗(yàn)證雌激素受體（estrogen receptor，ER）和孕激素受體（progesterone receptor，PR）均陰性，購(gòu)自美國(guó)ATCC公司。

實(shí)驗(yàn)藥物及器械麻醉劑水合氯醛購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中所需DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清等均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。顯微外科實(shí)驗(yàn)手術(shù)器械購(gòu)自上海市醫(yī)療器械總公司，高壓滅菌后使用。

細(xì)胞懸液法建立裸大鼠乳腺癌模型將凍存的MDA-MB-231細(xì)胞復(fù)蘇后，于含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)、傳代，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，胰酶消化后用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基重懸成5×107/mL細(xì)胞懸液，在裸大鼠左側(cè)近腋窩第二乳腺脂肪墊深面注射細(xì)胞懸液，形成一皮丘，內(nèi)含0.2mL細(xì)胞懸液（1×107個(gè)），共接種10只。

組織塊移植法建立裸大鼠乳腺癌模型細(xì)胞懸液法接種腫瘤細(xì)胞2周后，瘤體直徑已達(dá)1cm左右。隨機(jī)選取處死2只已成皮下瘤的裸大鼠，無(wú)菌條件下切取已形成的固體瘤塊，選取腫瘤邊緣?mèng)~肉狀瘤組織，在無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基中剪成約2mm3大小組織塊備用。裸大鼠水合氯醛（濃度4％，劑量1mL/100g體質(zhì)量）腹腔麻醉后，右側(cè)近腋窩第二乳腺脂肪墊部位皮膚消毒后，用套管針將修剪好的瘤塊塞入皮下約8～10mm的深度，至脂肪墊深面，共接種10只。

觀察與取材所有裸大鼠模型均自由食水，每?jī)商煊^察裸大鼠體質(zhì)量、精神狀態(tài)、攝食、活動(dòng)與營(yíng)養(yǎng)情況。造模后每?jī)商煊^察裸大鼠皮下成瘤情況，測(cè)量皮下瘤長(zhǎng)徑（a）和寬徑（b），計(jì)算體積（V=1/6πa×b2），以腫瘤體積和生長(zhǎng)時(shí)間作為坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線。同時(shí)記錄成瘤時(shí)間，腫瘤形狀，腫瘤表面皮膚情況。細(xì)胞懸液種植組的用于提供瘤塊接種于組織塊移植組2只裸鼠未參與統(tǒng)計(jì)，組織塊移植組2只瘤組織生長(zhǎng)陰性者也未參與統(tǒng)計(jì)。兩組有效統(tǒng)計(jì)的裸大鼠數(shù)量均為8只。

4周后，處死所有裸大鼠并切取腫瘤，用4％甲醛固定、脫水、石蠟包埋和切片，HE染色后顯微鏡下觀察并拍照。按照免疫組化的規(guī)范流程，進(jìn)行每個(gè)標(biāo)本的ER、PR、HER-2和Ki-67的免疫組化檢測(cè)，并觀測(cè)結(jié)果。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)以±s的方式表示。采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 21進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

裸大鼠的一般特征兩組裸大鼠的攝食和活動(dòng)狀態(tài)在早期無(wú)明顯差異。第3～4周時(shí)，兩組均有少數(shù)大鼠出現(xiàn)進(jìn)食和活動(dòng)量減少，體形略小于其他裸大鼠。兩組均無(wú)過(guò)程中死亡。

裸大鼠成瘤率細(xì)胞懸液法成瘤率100％，組織塊移植法成瘤率80％，兩組樣本率經(jīng)μ檢驗(yàn)（μ=1.49＜1.96），差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

裸大鼠腫瘤生長(zhǎng)情況細(xì)胞懸液組和組織塊組不同時(shí)間的腫瘤體積數(shù)據(jù)見(jiàn)表1，30天時(shí)兩組每只動(dòng)物荷瘤體積數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。比較兩組數(shù)據(jù)，雖然組織塊組稍早成瘤，但兩者生長(zhǎng)速度基本相同（圖1）。4周后實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，兩組成瘤體積經(jīng)t檢驗(yàn)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.274）。

表1 不同觀察時(shí)間的兩組的瘤塊體積Tab 1 Tumor volume of two groups in different time （±s）

表1 不同觀察時(shí)間的兩組的瘤塊體積Tab 1 Tumor volume of two groups in different time （±s）

Day（d）CSI group（mm3）TMT group（mm3）6 0 14.75±11.80 8 5.06±7.69 78.31±54.30 12 185.19±61.03 376.69±142.76 16 424.00±96.97 764.81±111.25 20 852.81±210.31 1 167.06±100.88 24 1 261.44±320.41 1 589.75±175.53 28 1 656.31±379.37 1 884.94±122.24 30 1 908.00±377.27 2 097.00±229.56

表2 30天時(shí)兩組動(dòng)物瘤塊體積Tab 2 Tumor volume of two groups on the 30th day

圖1 兩組的瘤塊體積-時(shí)間變化曲線Fig 1 Tumor volume-time curve of two groups

整個(gè)過(guò)程中，兩組裸大鼠呈局限膨脹性生長(zhǎng)，腫塊可呈分葉狀或橢球狀，未觀察到明顯的浸潤(rùn)或轉(zhuǎn)移灶出現(xiàn)，無(wú)皮膚發(fā)黑壞死破潰，皮膚與腫塊之間活動(dòng)性差，兩組間未見(jiàn)形態(tài)上的區(qū)別。

裸大鼠乳腺癌移植瘤巨檢形態(tài)學(xué)表現(xiàn)切開兩組裸大鼠瘤體，切面呈魚肉狀，色灰白或淡紅，質(zhì)脆易碎。個(gè)別腫塊中央?yún)^(qū)有少量壞死血腫現(xiàn)象，有黏液滲出。兩組的瘤組織均與宿主組織界限欠清晰，瘤體的被蓋（瘤體外周至皮膚的結(jié)構(gòu)）厚約4～5mm（圖2A），顯著厚于我們?cè)缙谕瓿傻穆阈∈笕橄侔┠Ｐ停s0.5mm，圖2B），更接近人體乳腺癌根治術(shù)的皮瓣厚度，易于縫合等操作，可更好地模擬人乳腺癌。

圖2 裸小鼠的瘤體被蓋組織厚度Fig 2 Tumor cover thickness of nude mice

裸大鼠乳腺癌移植瘤病理學(xué)表現(xiàn)兩組裸大鼠瘤組織HE染色均示腫瘤細(xì)胞排列密集、紊亂，細(xì)胞間質(zhì)少。瘤細(xì)胞呈團(tuán)狀或片狀排列，異常核分裂相易見(jiàn)，核質(zhì)比例增大，染色質(zhì)深且粗，核大深染，核仁明顯。腫瘤內(nèi)可見(jiàn)豐富的小血管。未見(jiàn)兩組間有明顯區(qū)別（圖3）。

圖3 兩組標(biāo)本的HE染色結(jié)果（×200）Fig 3 HE staining of two groups（×200）

兩組動(dòng)物的腫瘤免疫組化結(jié)果顯示ER、PR和Her-2染色均為陰性，Ki-67染色均為陽(yáng)性，符合細(xì)胞株MDA-MB-231的分子分型特性，未發(fā)生腫瘤生物學(xué)特性的轉(zhuǎn)變。也反映兩種造模方法在這些免疫組化指標(biāo)方面的表達(dá)沒(méi)有明顯區(qū)別（圖4）。

圖4 兩組標(biāo)本的免疫組化染色結(jié)果（×200）Fig 4 IHC staining of two groups（×200）

討論

制作裸大鼠乳腺癌模型的必要性及其優(yōu)勢(shì)腫瘤動(dòng)物模型是腫瘤學(xué)研究的基礎(chǔ)。對(duì)腫瘤進(jìn)行研究，必須建立相應(yīng)的動(dòng)物模型，以便對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)行機(jī)制研究［4］。早期的腫瘤模型一般通過(guò)自發(fā)或誘發(fā)建立鼠源性腫瘤，其與人瘤的生物學(xué)特性有較大差別，漸趨少用。

將人類腫瘤組織移植到無(wú)排斥反應(yīng)的動(dòng)物（如裸鼠）體內(nèi)，腫瘤移植后生長(zhǎng)良好，并具有保持原有的生物學(xué)特性等重要優(yōu)點(diǎn)，此種方法得以廣泛開展。1972年英國(guó)學(xué)者成功培育了裸小鼠，裸大鼠種群也在1977年于英國(guó)成功建立［5］。

在人乳腺癌的動(dòng)物模型制作方面，廣泛應(yīng)用裸小鼠為載體進(jìn)行，技術(shù)已經(jīng)很成熟。由于裸大鼠較難獲得且價(jià)格昂貴等原因，國(guó)內(nèi)外對(duì)其關(guān)注度遠(yuǎn)較裸小鼠少。目前有關(guān)裸大鼠人乳腺癌皮下移植瘤模型的文獻(xiàn)國(guó)內(nèi)未見(jiàn)報(bào)道。

與裸小鼠乳腺癌模型比較，裸大鼠模型有明顯的優(yōu)點(diǎn)。性成熟期的裸大鼠體重是同期裸小鼠體重10～12倍，如需對(duì)動(dòng)物模型的腫瘤進(jìn)行手術(shù)操作時(shí)，體積相對(duì)較大的裸大鼠較裸小鼠具有極大優(yōu)勢(shì)，不僅麻醉致死風(fēng)險(xiǎn)小，而且體型大、皮膚及皮下組織厚，更適合術(shù)者進(jìn)行操作［6］。本課題的提出是基于作者在另一乳腺癌研究課題中需要對(duì)動(dòng)物模型手術(shù)的需求；裸大鼠的乳腺癌組織至皮膚的厚度在4～5mm，較裸小鼠薄如紙張的0.5mm，手術(shù)操作難度明顯降低。

裸大鼠乳腺癌模型的其他優(yōu)勢(shì)為：（1）裸小鼠乳腺癌模型腫塊生長(zhǎng)至長(zhǎng)徑大于10mm后，極易出現(xiàn)皮膚潰瘍壞死，繼發(fā)感染導(dǎo)致瘤組織無(wú)法使用，或致裸小鼠死亡，造模失敗，裸大鼠不容易產(chǎn)生類似現(xiàn)象，最終產(chǎn)瘤量大，可獲得大量腫瘤組織進(jìn)行的分子生物學(xué)檢測(cè)，如免疫組化或Western blot等［6］。（2）如需要較多血液進(jìn)行血清學(xué)或其他指標(biāo)的檢測(cè)，則裸大鼠更有優(yōu)勢(shì)。處死一只裸大鼠后可獲得6～10mL血液，而處死1只裸小鼠后只能獲得1～2mL血液。如只需獲得裸大鼠的少量血液，不需要處死動(dòng)物，只需股動(dòng)脈采血，也可獲得1～2mL血液［6］。

目前已經(jīng)有一些裸大鼠腫瘤模型的報(bào)道，如胰腺癌［7］、腸癌［8］和乳腺癌［9-10］等。

制作模型中的技術(shù)注意點(diǎn)和改進(jìn)在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，我們反復(fù)摸索，有如下一些技術(shù)上的心得：（1）進(jìn)行組織塊移植時(shí)，如在體外暴露時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，則腫瘤細(xì)胞極易死亡，導(dǎo)致接種失敗，因此我們將組織放在培養(yǎng)基中進(jìn)行修剪。（2）在研究組織塊移植模型制作時(shí)，經(jīng)反復(fù)預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，體積在2mm3左右有較好的成瘤效果；選取瘤塊時(shí)應(yīng)盡量挑選靠近包膜的腫瘤組織，避免選用腫瘤中央的組織，因?yàn)閻盒阅[瘤生長(zhǎng)較快，腫瘤中央組織常伴出血、壞死、液化，活性較差，而包膜處的瘤組織多含增殖活躍的腫瘤細(xì)胞。（3）為了提高成瘤率，裸大鼠乳腺脂肪墊內(nèi)原位移植效果好于其他部位。（4）在異體腫瘤移植方面，受體動(dòng)物的年齡至關(guān)重要，可以提高移植的成功率［11］，裸大鼠實(shí)施異體腫瘤移植時(shí)間不應(yīng)晚于出生后8周，因此本研究采用4～5周齡的裸大鼠。

國(guó)外作者報(bào)道［9-10］，為了增加裸大鼠的成瘤率，需要在裸大鼠皮下埋置緩釋雌激素制劑，或在細(xì)胞懸液中混入基質(zhì)膠以刺激生長(zhǎng)，增加成功率。在本研究中未使用這兩種物質(zhì)，同樣達(dá)到了100％的成功率，且生長(zhǎng)速度無(wú)明顯區(qū)別。究其原因，可能與使用成瘤能力較強(qiáng)的乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231有關(guān)。

細(xì)胞懸液法和組織塊法的共同點(diǎn)與區(qū)別在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)組織塊法種植后，由于組織塊本身有一定的體積，所以生長(zhǎng)到被捫及比較早，但后期生長(zhǎng)速度與細(xì)胞懸液方法類似。所得腫塊外形相似，未見(jiàn)其他學(xué)者所報(bào)道的在裸小鼠乳腺癌模型結(jié)節(jié)等肉眼觀察上的區(qū)別［12］。HE染色后鏡下觀察的病理和免疫組化指標(biāo)均高度一致，且符合接種的乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231的原有生物學(xué)特性。用這兩種方法制作的裸大鼠乳腺癌造模型未見(jiàn)明顯區(qū)別，均可用于人乳腺癌的研究。

總之，本試驗(yàn)采用兩種方法建立的裸大鼠人乳腺癌皮下移植瘤在組織形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)等方面均符合惡性腫瘤的特性，與人乳腺癌生物學(xué)特性一致，因此本模型可用于乳腺癌的病因?qū)W、生物學(xué)以及治療學(xué)等方面的研究。而且裸大鼠體型、器官、血管等均較裸小鼠大，更適合體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究的復(fù)雜操作，從而為更好開展乳腺癌的研究提供了良好的動(dòng)物模型。

［1］Siegel R，Naishadham D，Jemal A.Cancer statistics for Hispanics/Latinos［J］.CA Cancer J Cltn，2012，62（5）：283-298.

［2］Kraft P，Haiman CA.GWAS identifies a common breast cancer risk allele among BRCA1 carriers［J］.Nat Genet， 2010，42（10）：819-820.

［3］鄭瑩，吳春曉，張敏璐.乳腺癌在中國(guó)的流行狀況和疾病特征［J］.中國(guó)癌癥雜志，2013，23（8）：561-569.

［4］高進(jìn).動(dòng)物腫瘤模型的建立及其標(biāo)準(zhǔn)研討［J］.中國(guó)腫瘤生物治療雜志，1995，2（1）：76-79.

［5］楊萍.簡(jiǎn)明實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)［M］.上海：復(fù)旦大學(xué)出版社，2003：92.

［6］施新猷，王四旺，等.比較醫(yī)學(xué)［M］.陜西：陜西科學(xué)技術(shù)出版社，2003：105.

［7］Cheng C，Pan L，Dimitrakopoulou-Strauss A，et al.Comparison between 68Ga-bombesin（68Ga-BZH3）and the cRGD tetramer 68Ga-RGD4 studies in an experimental nude rat model with a neuroendocrine pancreatic tumor cell line［J］.EJNMMI Res，2011，1：34

［8］Tai JH，Tessier J，Ryan AJ，et al.Assessment of acute antivascular effects of vandetanib with high-resolution dynamic contrast-enhanced computed tomographic imaging in a human colon tumor xenograft model in the nude rat［J］.Neoplasta，2010，12（9）：697-707.

［9］Direcks WG，van Gelder M，Lammertsma AA，et al.A new rat model of human breast cancer for evaluating efficacy of new anti-cancer agentstn vtvo［J］.Cancer Btol her，2008，7（4）：532-537.

［10］Sauer LA，Dauchy RT，Blask DE，et al.Eicosapentaenoic acid suppresses cell proliferation in MCF-7 human breast cancer xenografts in nude rats via a pertussis toxinsensitive signal transduction pathway［J］.J Nutr，2005，135（9）：2124-2129.

［11］Smyth MJ，Hayakawa Y，Takeda K，et al.New aspects of natural killer cell surveilliance and therapy of cancer［J］.Nat Rev Cancer，2002，2（11）：850-861.

［12］龔英，汪登斌.兩種MDA-M-231乳腺癌細(xì)胞原位移植型裸鼠模型制作比較［J］.上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2007，27（7）：818-821.

Establishment and evaluation of the animal model of human breast carcinoma with nude rats

JIA Luo-qi1▲，WANG Chao2▲，CHENG Ming-jun1，SUN Jian3△
（1Reasarch Instttute，2Department of Pathology，3Department of Breast Surgery，Obstetrtcs and Gynaecology Hospttal，F(xiàn)udan Untverstty，Shanghat200011，chtna）

ObjectiveTo establish the subcutaneous human breast carcinoma models by two different methods（injection of cell suspensions and transplantation of tissues）and to observe their biological features.MethodsThe subcutaneous tumor models were prepared by injection of cultured breast cancer cells suspensions directly or by transplantation of tumor tissue mass.MDA-MA-231 cell line was cultured in-vitro and inoculated subcutaneously into ten female nude rats.In 2 weeks 2 nude rates were sacrificed and the subcutaneous tumors were excised.The tumours were cut into small mass with volume of 2mm3，and then transplanted subcutaneously into another ten female nude rats.All nude rates were sacrificed in 4 weeks.The carcinoma mass were excised and studied through histopathology and immunohistochemistry.ResultsThe subcutaneous tumors of the human breast carcinoma were generated in all 10 nude rats by injection of breast cancer cells suspensions，and in 8 of 10 nude rates by transplantation of tumor mass.The biological features of those 2 tumour models analyzed by HE staining and immunohistochemistry were showed with similarity as human breast carcinoma.ConclusionsBoth subcutaneous tumor models by the two different methods using nude rat can be served as ideal disease models tn vtvo study of human breast carcinoma.

breast cancer；nude rats；animal model

R 73-35

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2014.05.020

上海市衛(wèi)生局課題（2010049）；上海市衛(wèi)生局青年科研基金（2010Y163）

▲Co-first authors

△Corresponding author E-mail：apollojian@sina.com

2014-01-06；編輯：段佳）