皖南地區(qū)常見松針抑菌效果研究

曹 侃,張 爽，翁澤斌，顏翠萍，李偉東

(1.蕪湖職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物工程學(xué)院，安徽 蕪湖 241000；2.南京中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 南京 210023)

皖南地區(qū)常見松針抑菌效果研究

曹 侃1,張 爽1，翁澤斌2，顏翠萍2，李偉東2

(1.蕪湖職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物工程學(xué)院，安徽 蕪湖 241000；2.南京中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 南京 210023)

為研究松針提取物抑菌效果，采用馬尾松和雪松松針的水、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇浸提物，分別對白色念珠菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌進(jìn)行抑菌實(shí)驗。結(jié)果表明，松針抑菌作用由強(qiáng)到弱的部位為正丁醇部位>乙酸乙酯部位>氯仿部位，總體上雪松的抑菌作用要強(qiáng)于馬尾松，松針提取物的體外抑菌作用跟松針的品種、部位以及供試菌種的種類有關(guān)。該研究可為今后松針抑菌作用的開發(fā)利用提供方向。

松針；提取物；抑菌效果

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)很多植物都具有較強(qiáng)的抑菌作用，可以此作為天然防腐劑、抑菌劑來進(jìn)行開發(fā)利用。皖南地區(qū)的松針資源非常豐富，尤以馬尾松、雪松最為常見。關(guān)于松針抑菌研究的報道并不多見，而且主要集中在研究松針對腐敗菌的抑制作用上[1-2]，如曾維才[3]等在研究中發(fā)現(xiàn)，松針的水提和醇提物對常見食品腐敗菌有明顯的抑制作用。對于大多數(shù)的腐敗菌來說，松針?biāo)嵛锏囊志Ч却继嵛锩黠@。徐麗珊[4]等在松針提取物的抑菌作用實(shí)驗中發(fā)現(xiàn)，濕地松提取液對枯草桿菌、曲霉的抑菌效果顯著。這些前期的研究都沒有針對雪松松針的研究，而且抑菌的菌種類型比較單一，采用的浸提方式也較少，不足以全面的分析出馬尾松和雪松松針的抑菌效果。因此，本實(shí)驗對以上方面進(jìn)行改進(jìn)，對本地區(qū)采集的馬尾松、雪松的松針樣本進(jìn)行了抑菌實(shí)驗研究，希望能為本地區(qū)松針資源的進(jìn)一步開發(fā)利用打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

本實(shí)驗將皖南地區(qū)采集的馬尾松和雪松松針作為樣品，分別制備其水提、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇浸提物，以中藥銀黃顆粒、西藥林可霉素作為對照，針對標(biāo)準(zhǔn)白色念珠菌、標(biāo)準(zhǔn)銅綠假單胞菌、臨床分離的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌，分別采用平皿法、試管法和牛津杯法進(jìn)行體外抑菌作用的篩選實(shí)驗。

1.1 松針來源

雪松松針采自安徽省蕪湖市蕪湖職業(yè)技術(shù)學(xué)院南校區(qū)校園內(nèi)，馬尾松松針采自安徽省黃山市黃山區(qū)湯口鎮(zhèn)芳村205國道道班下三坑向陽坡處。雪松和馬尾松松針?biāo)幉木?jīng)過南京中醫(yī)藥大學(xué)陳建偉教授鑒定，為松科植物雪松屬及松科植物松屬的針葉。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器

FA1004電子天平(上海精科天平廠)；隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)；YXQ-2S-50SⅡ立式壓力蒸汽滅菌器(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；生物安全柜BSC-1500ⅡA2-X(濟(jì)南鑫貝亞生物技術(shù)有限公司)。

1.2.2 試劑

乙腈(美國TEDIA試劑公司，HPLC級)；水(南京EPED制超純水)；甲酸(南京化學(xué)試劑有限公司，分析純)，乙酸乙酯(南京化學(xué)試劑有限公司，分析純)，氯仿(南京化學(xué)試劑有限公司，分析純)，正丁醇(南京化學(xué)試劑有限公司，分析純)，其余試劑均為分析純。

銀黃顆粒(江西濟(jì)民可信藥業(yè)有限公司，批號：121203)；林可霉素(金陵藥業(yè)股份有限公司南京金陵制藥廠提供，批號：121005)；氯化鈉(南京小營藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號：12012091301)；營養(yǎng)瓊脂(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：20111228)；營養(yǎng)肉湯(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：20120420)。

1.3 實(shí)驗菌株

標(biāo)準(zhǔn)菌株：白色念珠菌(98001)、銅綠假單胞菌(27853)，由衛(wèi)生部微生物鑒定所提供。

臨床分離菌株：金黃色葡萄球菌、大腸桿菌，由江蘇省人民醫(yī)院微生物鑒定室提供。

1.4 實(shí)驗方法

1.4.1 松針浸提

采集的雪松松針和馬尾松松針經(jīng)蕪湖市中醫(yī)院藥劑科粉粹成1 cm的小段后干燥成初樣品。取雪松和馬尾松松針各200 g，分別以10倍量和8倍量的水煎煮2次，合并提取液，于90 ℃水浴濃縮至200 mL，分別以三氯甲烷、乙酸乙酯、水飽和正丁醇各200 mL萃取3次，萃取液于90 ℃濃縮至干，以無水乙醇溶解，定容于50 mL容量瓶中，分別獲得相當(dāng)于生藥濃度4 g/mL的馬尾松和雪松松針的氯仿浸提物、乙酸乙酯浸提物、正丁醇浸提物；然后將萃取剩余藥液定容至500 mL，取100 mL加乙醇至醇濃度到50%，靜置，過濾，于90 ℃濃縮至干，以50%乙醇定容于10 mL量瓶，配置成相當(dāng)于生藥濃度4 g/mL的馬尾松和雪松的水提物；最后分別過0.45 μm微孔濾膜作為供試品溶液，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 林可霉素

在生物安全柜內(nèi)取林可霉素0.67 mL(300 mg/mL)加生理鹽水至10 mL，配成濃度為20 mg/mL的溶液。

1.4.3 銀黃顆粒

精密稱取銀黃顆粒10 g加蒸餾水至10 mL，配成濃度為1 g/mL的溶液，溶解后于121 ℃消毒20 min備用。

1.4.4 抑菌實(shí)驗

1.4.4.1 增菌培養(yǎng)

取標(biāo)準(zhǔn)白色念珠菌、銅綠假單胞菌、臨床分離大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的菌株少許接種于肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)18 h，取出用生理鹽水稀釋至10-6備用。

1.4.4.2 平皿法

采用平皿打洞法將實(shí)驗菌株接種于營養(yǎng)肉湯中，37 ℃培養(yǎng)18 h，制成肉湯菌液，取出用滅菌后的生理鹽水稀釋至10-6備用。取肉湯瓊脂培養(yǎng)基溶化后倒入9 cm平皿約20 mL，待其凝固。用滅菌棉簽蘸取菌液均勻涂布于營養(yǎng)瓊脂平板，然后用直徑6 mm無菌鋼圈均勻打洞，每平皿打4個洞，去除洞內(nèi)瓊脂后將供試藥液加于洞中，以滿而不溢為宜并作好標(biāo)記，每樣品做2個重復(fù)，37 ℃恒溫培養(yǎng)20 h后取出，觀察結(jié)果，測定抑菌圈直徑。結(jié)果判斷：抑菌圈直徑小于10 mm為低度敏感或耐藥；10～15 mm為中度敏感；大于15 mm為高度敏感[5]。

1.4.4.3 試管法

采用試管兩倍稀釋法測定樣品對供試菌株的MIC。取18 h培養(yǎng)的各菌株營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物，用滅菌后的生理鹽水做10-6稀釋用于實(shí)驗。取無菌試管8支，第1～8管各加1 mL營養(yǎng)肉湯；以無菌操作吸取已稀釋好的藥物1 mL，加入第一管?；靹蚝笪? mL加入第2管中，依次倍比稀釋至第7管，混勻后自第7管棄去1 mL，此時，管中藥液濃度比依次為1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128，第8管不加藥物為對照；將肉湯培養(yǎng)18 h的供試菌液用無菌生理鹽水稀釋成10-6濃度，然后各管均加入供試菌液0.05 mL，混勻后，置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)16～18 h，觀察結(jié)果。若肉湯混濁，表示細(xì)菌生長；若肉湯完全清亮，表示無細(xì)菌生長。

將上述MIC測定中未生長細(xì)菌的各管中的肉湯接種于營養(yǎng)瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)18 h后觀察有無細(xì)菌生長，以細(xì)菌不生長的最高藥物稀釋度為該藥的最低抑菌濃度(MIC)(按生藥量計算)，以濁度為指標(biāo)檢查試管中有無細(xì)菌生長，以仍無細(xì)菌生長的管內(nèi)藥物的濃度為該藥的最小殺菌濃度(MBC)。重復(fù)1次。

1.4.4.4 牛津杯法

牛津杯和松針提取物在121 ℃條件下高壓滅菌20 min，冷卻備用。將牛津杯放置于已冷卻的含菌雙碟平板表面，吸取150 μL的松針提取物分別注入牛津杯中，于37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察各平板抑菌圈直徑大小。每組2個平板，每個平板放置2個牛津杯，重復(fù)2次，抑菌圈直徑取平均值。

以上抑菌實(shí)驗均為2個重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 平皿法結(jié)果

雪松和馬尾松松針各部位體外抑菌作用平皿法篩選實(shí)驗結(jié)果如表1所示。藥物樣品5、6、7、8采用平皿法對標(biāo)準(zhǔn)白色念珠菌中度敏感，抑菌范圍為12.5～14.25 mm；藥物樣品6、8對臨床分離金黃色葡萄球菌中度敏感，抑菌范圍為10.5～14.5 mm；藥物樣品8對標(biāo)準(zhǔn)銅綠假單胞菌、臨床分離大腸桿菌中度敏感，抑菌范圍為13～15 mm。

表1 體外抑菌作用篩選實(shí)驗(平皿法n=2)

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)白色念珠菌結(jié)果

平皿法對標(biāo)準(zhǔn)白色念珠菌的抑菌實(shí)驗結(jié)果如圖1所示。

圖1 平皿法標(biāo)準(zhǔn)白色念珠菌結(jié)果

圖中(1)為馬尾松、雪松水提物結(jié)果；(2)為馬尾松、雪松氯仿部位結(jié)果；(3)為馬尾松、雪松乙酸乙酯部位結(jié)果；(4)為馬尾松、雪松正丁醇部位結(jié)果；(5)為林可霉素結(jié)果；(6)為銀黃顆粒結(jié)果。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)銅綠假單胞菌結(jié)果

平皿法對標(biāo)準(zhǔn)銅綠假單胞菌的抑菌實(shí)驗結(jié)果如圖2所示。

圖2 平皿法標(biāo)準(zhǔn)銅綠假單胞菌結(jié)果

圖中(1)為馬尾松、雪松水提物結(jié)果；(2)為馬尾松、雪松氯仿部位結(jié)果；(3)為馬尾松、雪松乙酸乙酯部位結(jié)果；(4)為馬尾松、雪松正丁醇部位結(jié)果；(5)為林可霉素結(jié)果；(6)為銀黃顆粒結(jié)果。

2.1.3 大腸桿菌結(jié)果

平皿法對大腸桿菌的抑菌實(shí)驗結(jié)果如圖3所示。

圖3 平皿法大腸桿菌結(jié)果

圖中(1)為馬尾松、雪松水提物結(jié)果；(2)為馬尾松、雪松氯仿部位結(jié)果；(3)為馬尾松、雪松乙酸乙酯部位結(jié)果；(4)為馬尾松、雪松正丁醇部位結(jié)果；(5)為林可霉素結(jié)果；(6)為銀黃顆粒結(jié)果。

2.1.4 金黃色葡萄球菌結(jié)果

平皿法對金黃色葡萄球菌的抑菌實(shí)驗結(jié)果如圖4所示。

圖4 平皿法金黃色葡萄球菌結(jié)果

圖中(1)為馬尾松、雪松水提物結(jié)果；(2)為馬尾松、雪松氯仿部位結(jié)果；(3)為馬尾松、雪松乙酸乙酯部位結(jié)果；(4)為馬尾松、雪松正丁醇部位結(jié)果；(5)為林可霉素結(jié)果；(6)為銀黃顆粒結(jié)果。

2.2 試管法結(jié)果

雪松和馬尾松松針各部位體外抑菌作用試管法篩選實(shí)驗結(jié)果如表2所示。藥物樣品1、2、5、6、7、8采用試管法對臨床分離的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌有抑菌作用，抑菌MIC為0.125～1.25 g/mL；藥物樣品1、2、5、6、7、8對標(biāo)準(zhǔn)白色念珠菌、銅綠假單胞菌有抑菌作用，抑菌MIC為0.125～1 g/mL；藥物樣品3對標(biāo)準(zhǔn)白色念珠菌有抑菌作用，抑菌MIC為1 g/mL。

表2 體外抑菌作用篩選實(shí)驗(試管法n=2)

2.3 牛津杯法結(jié)果

雪松和馬尾松松針各部位體外抑菌作用牛津杯法篩選實(shí)驗結(jié)果如表3所示。藥物樣品1、2、3、4、5、6、7、8采用牛津杯法對標(biāo)準(zhǔn)白色念珠菌、銅綠假單胞菌、臨床分離金黃色葡萄球菌、大腸桿菌不敏感。

表3 體外抑菌作用篩選實(shí)驗(牛津杯法n=2)

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，馬尾松和雪松松針的不同提取物對標(biāo)準(zhǔn)白色念珠菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌均有一定程度的抑菌作用；然而不同品種的松針、同一種松針的不同提取物，對不同供試菌的抑菌作用有明顯差異。

實(shí)驗結(jié)果顯示，雪松松針對供試菌的抑菌作用強(qiáng)于馬尾松，不同提取物的抑菌作用為正丁醇>乙酸乙酯>氯仿，因此未來在研發(fā)松針抑菌劑時可以考慮以雪松的正丁醇浸提物作為重點(diǎn)；同時在本實(shí)驗研究的供試菌中，松針提取物對標(biāo)準(zhǔn)白色念珠菌的抑菌效果更為明顯，因此可以重點(diǎn)開發(fā)松針對含有標(biāo)準(zhǔn)白色念珠菌物質(zhì)的保護(hù)。

[1] 肖靖萍,任宇紅.松針抑菌作用的研究[J].食品科學(xué),1994(2):52-54.

[2] 張軍民,石曉峰,范彬.雪松的化學(xué)成分及藥理活性研究進(jìn)展[J].中成藥,2009,31(6):928-933.

[3] 曾維才,賈利蓉.松針提取物抑菌作用的研究[J].食品科學(xué),2009,30(7):87-90.

[4] 徐麗珊,張萍華,張敏歡.松針提取物的抑菌作用初探[J].食品科學(xué),2009,30(1):38-41.

[5] 李榆梅.微生物學(xué)[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2002:131-132.

2014-06-26

安徽省青年人才基金項目：裕溪口香菜中腐敗菌菌相分析及保鮮技術(shù)研究(2010SQRW188)；安徽省省級專業(yè)綜合改革試點(diǎn)：食品營養(yǎng)與檢測專業(yè)(2013zy101)；蕪湖職業(yè)技術(shù)學(xué)院自然科學(xué)研究項目：皖南地區(qū)松針抗氧化有效部位的篩選及特征圖譜的研究(Wzyzr201315)

曹侃(1984-)，女，安徽蕪湖人，蕪湖職業(yè)技術(shù)學(xué)院講師，碩士。研究方向：生物技術(shù)； 通訊作者：李偉東(1969-)，男，江蘇南京人，南京中醫(yī)藥大學(xué)副研究員，博士。研究方向：中藥學(xué)。

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1008-4657(2014)04-0020-07

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