津力達(dá)對胰島素抵抗大鼠骨骼肌GLUT4表達(dá)的影響

臧莎莎 劉頤軒 宋光耀 王超

·論著·

津力達(dá)對胰島素抵抗大鼠骨骼肌GLUT4表達(dá)的影響

臧莎莎 劉頤軒 宋光耀 王超

目的探討津力達(dá)對胰島素抵抗大鼠骨骼肌GLUT4表達(dá)的影響。方法SD大鼠分為正常對照組(ND組),高脂對照組(HFD組),津力達(dá)組及吡格列酮組，每組6只;灌胃8周后,進(jìn)行腹腔注射葡萄糖耐量試驗(yàn)并計(jì)算曲線下面積(AUC);測得大鼠空腹血糖、胰島素計(jì)算HOMA-IR指數(shù);RT-PCR及western-blotting檢測大鼠骨骼肌GLUT4表達(dá)。結(jié)果津力達(dá)明顯改善了30 min、60 min血糖及AUC,吡格列酮改善了60、120 min血糖及AUC(P<0.05);津力達(dá)及吡格列酮明顯改善HOMA-IR指數(shù)(P<0.05);津力達(dá)及吡格列酮明顯上調(diào)了骨骼肌GLUT4的表達(dá)。結(jié)論津力達(dá)能夠上調(diào)大鼠骨骼肌GLUT4的表達(dá),改善高脂飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗。

津力達(dá);胰島素抵抗;骨骼肌;GLUT4

胰島素抵抗是2型糖尿病的病理基礎(chǔ)[1]。骨骼肌是一關(guān)鍵的代謝組織,能夠處置餐后70%～90%葡萄糖,骨骼肌胰島素抵抗的發(fā)生對全身胰島素的敏感性產(chǎn)生重要影響[2]。骨骼肌組織中的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子4(GLUT4)是胰島素作用下的主要葡萄糖運(yùn)載體。高脂飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗的發(fā)生常伴隨胰島素刺激下GLUT4表達(dá)及轉(zhuǎn)位的異常。中成藥津力達(dá)主要用于胰島素抵抗及2型糖尿病的治療,但其分子機(jī)制尚未明確。本實(shí)驗(yàn)主要觀察津力達(dá)對胰島素抵抗大鼠骨骼肌GLUT4表達(dá)的影響,進(jìn)一步明確其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料 津力達(dá)中成藥由河北以嶺藥業(yè)提供;鹽酸吡格列酮片,規(guī)格15 mg/片,由日本武田制藥有限公司生產(chǎn);GLUT4抗體購于Signalway公司,β-actin抗體及辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗購自ProteinTech Group公司;ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購于上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級雄性SD大鼠36只，體重(140±20)g均購自北京維通利華有限責(zé)任公司,許可證號(hào)：slxk(京)7009-0017。

1.3 實(shí)驗(yàn)飼料 基礎(chǔ)飼料購自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,熱量組成:碳水化合物65.5%，脂肪10.3%，蛋白質(zhì)24.2%，總熱量為348 kcal/100 g;自制高脂飼料熱量組成:碳水化合物20.1%，脂肪59.8%，蛋白質(zhì)占20.1%，總熱量為501 kcal/100 g。

1.4 方法

1.4.1 動(dòng)物分組:36只雄性SD大鼠隨機(jī)分為2組:12只予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng),24只予高脂喂養(yǎng)。6周后每組各取6只行正葡萄糖高胰島素鉗夾實(shí)驗(yàn)判斷IR模型造模成功?；A(chǔ)飼料喂養(yǎng)的剩余6只繼續(xù)予基礎(chǔ)飼料作為正常對照組(ND組);高脂喂養(yǎng)造模成功的18只進(jìn)一步分組:高脂對照組(HFD組),吡格列酮治療組給予4.5 mg·kg-1·d-1,津力達(dá)治療組給予1.5 g·kg-1·d-1,吡格列酮與津力達(dá)溶液用0.5%的羥甲基纖維素鈉配置。灌胃給藥1次/d,正常、高脂對照組予同體積0.9%氯化鈉溶液灌胃,每周測量體重及統(tǒng)計(jì)攝食量。灌胃第8周,腹主動(dòng)脈放血處死大鼠,留取血清;留取股四頭肌標(biāo)本，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 高胰島素-正葡萄糖鉗夾試驗(yàn):60 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，行右頸動(dòng)脈、右頸靜脈插管術(shù)，導(dǎo)管經(jīng)皮下由耳后引出并固定，用100 U/ml肝素封管，結(jié)扎固定于頸后皮膚。插管術(shù)后3～5 d，待大鼠恢復(fù)體重，禁食12 h過夜，次日在特制的鼠籠中行清醒狀態(tài)下高胰島素-正葡萄糖鉗夾實(shí)驗(yàn)。測定基礎(chǔ)血糖值后，以4 mU·kg-1·min-1勻速輸注胰島素,使大鼠體內(nèi)的胰島素水平迅速升高。其后每10分鐘測定1次靜脈血糖，輸注并調(diào)整30%葡萄糖溶液的輸注率，使維持血糖在(5.0±0.5)mmol/L，連續(xù)3次以上血糖在上述范圍即表明達(dá)到穩(wěn)態(tài)，取穩(wěn)態(tài)下5～6次葡萄糖輸注率(GIR)的平均值作為大鼠胰島素敏感性的評價(jià)指標(biāo)[3]。

1.4.3 腹腔注射葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn):首先尾靜脈放血測得大鼠空腹血糖,然后腹腔注射50%的葡萄糖(2 g/kg),注射后用快速血糖測定儀測定5、10、30、60、120 min的血糖,并計(jì)算葡萄糖曲線下面積(AUC)。

1.4.4 計(jì)算HOMA-IR:測得大鼠空腹血糖與胰島素,胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)=空腹血糖×空腹胰島素/22.5[4]。

1.4.5 RT-PCR檢測：用Trizol法提取小鼠骨骼肌總RNA,RT-PCR采用Syber Green I GoTaq qPCR Master Mix試劑盒在ABI PRISM 7300 PCR 儀上進(jìn)行。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性10 min，隨后95℃變性15 s 40個(gè)循環(huán)，58℃退火20 s，72℃延伸30 s。GLUT4上游引物5’-ATACTCATTCTCGGACGGTTC-3’,下游引物5’-CCCACATACATAGGCACCAA-3’;β-actin上游引物5’-TGTGATGGTGGGTATGGGT-3’,下游引物5’-AGGATGCCTCTCTTGCTCTG-3’。反應(yīng)結(jié)束后，按照各反應(yīng)孔Ct值,以β-actin 基因?yàn)閮?nèi)參，根據(jù)公式2-△Ct計(jì)算各樣品目的基因相對表達(dá)量。

1.4.6 骨骼肌GLUT4蛋白表達(dá)：采用 Western-blotting方法測定。冷凍的骨骼肌組織稱質(zhì)量，加入組織裂解液提取蛋白并定量。取30 μg進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白后轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯 (PVDF)膜，封閉液室溫封閉4 h,GLUT4、β-actin一抗4℃搖床過夜,洗膜后再加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗,室溫孵育2 h,用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒暗室顯影。

2 結(jié)果

2.1 腹腔注射葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn) 與ND組相比，HFD組0、5、30、60、120 min血糖及AUC明顯升高(P<0.05)。津力達(dá)組30、 60血糖及AUC較HFD組降低(P<0.05)，較ND組升高(P<0.05)；吡格列酮組60、120 min及AUC較HFD組降低(P<0.05)，較ND組升高(P<0.05)。見表1。

2.2 HOMA-IR 與ND組相比，HFD組HOMA-IR指數(shù)明顯升高(P<0.05)；津力達(dá)及吡格列酮組HOMA-IR指數(shù)較ND組升高，較HFD組降低(P<0.05)。見表1。

表1 4組血糖和AUC及HOMA-IR比較

項(xiàng)目ND組HFD組津力達(dá)組吡格列酮組血糖(mmol/L) 0min4.60±0.326.60±0.52*5.73±0.385.97±0.38 5min9.63±0.4712.33±0.55*10.20±0.679.67±0.60 10min12.80±1.3216.70±0.8511.83±1.4413.57±0.55 30min9.70±0.2117.10±0.21*15.30±0.61*15.47±0.75* 60min7.07±0.4114.47±0.81*10.13±0.38*#9.67±0.52*# 120min5.43±0.098.17±0.15*6.10±0.26#6.40±0.21#AUC15.72±0.5026.84±0.63*20.58±0.91*#20.78±0.55*#HOMA-IR2.27±0.228.70±0.39*3.88±0.38*#3.52±0.34*#

注：與ND組比較，*P<0.05；與HFD組比較，#P<0.05

2.3 大鼠骨骼肌GLUT4 mRNA及蛋白的表達(dá) 骨骼肌GLUT4 mRNA及蛋白表達(dá)HFD組低于ND組(P<0.05)，津力達(dá)及吡格列酮組較HFD組mRNA及蛋白表達(dá)升高(P<0.05)。見圖1。

圖1 不同組間GLUT4蛋白及mRNA表達(dá)的比較

3 討論

隨著生活方式的改變,糖尿病的發(fā)病率日益增加。中醫(yī)藥作為祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)在醫(yī)學(xué)體系中占據(jù)重要地位，近年來一些中成藥的降糖效果得到了人們的認(rèn)可,在糖尿病治療方面取得了一定成果。本課題研究的主要內(nèi)容是降糖藥物津力達(dá),它是一種中成藥,由人參、黃精、蒼術(shù)(炒)、苦參、麥冬、地黃等十幾味中藥制成,但其具體的降糖機(jī)制尚不明確。

胰島素抵抗(insulin resistance,IR)主要表現(xiàn)為胰島素對其靶組織的生理效應(yīng)降低，胰島素介導(dǎo)下骨骼肌、脂肪組織對葡萄糖的攝取、利用或儲(chǔ)存的效力減弱[3]。骨骼肌是胰島素刺激葡萄糖利用的主要組織,因而也是IR的主要部位。骨骼肌IR的發(fā)生對于全身IR的發(fā)生發(fā)揮重要作用[4]。

葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子4(GLUT4)是一種糖蛋白,主要存在于胰島素敏感組織如骨骼肌、心肌和脂肪細(xì)胞中,直接參與細(xì)胞對葡萄糖的攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)[5]。GLUT4是骨骼肌細(xì)胞利用葡萄糖的主要限速步驟,其表達(dá)減少或轉(zhuǎn)運(yùn)障礙直接導(dǎo)致骨骼肌對葡萄糖的攝取障礙,進(jìn)而導(dǎo)致高血糖[6]。未受到刺激時(shí)90% GLUT4分布在細(xì)胞內(nèi):如微粒體、高爾基復(fù)合體、管型囊等囊泡樣結(jié)構(gòu)中,當(dāng)肌肉收縮或受到胰島素刺激后通過胰島素受體-胰島素受體底物1-磷脂酰肌醇3激酶-AKT/PKB等一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路使得GLUT4轉(zhuǎn)位到細(xì)胞膜來攝取葡萄糖[7]。本研究中高脂飲食組與正常組比較,骨骼肌GLUT4 mRNA及蛋白的表達(dá)明顯減低,因而攝取葡萄糖的能力減低,HOMA-IR升高,出現(xiàn)了胰島素抵抗,津力達(dá)干預(yù)之后明顯上調(diào)了骨骼肌GLUT4的表達(dá),改善了HOMA-IR及曲線下面積AUC。

綜上,本研究發(fā)現(xiàn)高脂飲食會(huì)誘導(dǎo)胰島素抵抗的發(fā)生,伴隨骨骼肌組織GLUT4表達(dá)的下調(diào);津力達(dá)干預(yù)可以上調(diào)GLUT4的表達(dá),增加葡萄糖的攝取,改善胰島素抵抗,為津力達(dá)的臨床應(yīng)用提供了分子水平的理論支持。

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EffectofJinlidaontheexpressionofGLUT4inskeletalmuscleofratswithinsulinresistance

ZANGShasha*,LIUYixuan*,SONGGuangyao,etal.*InstituteofPostgraduateStudentsofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050017,China

ObjectiveTo investigate the effect of Jinlida on the expression of GLUT4 in skeletal muscle of rats with insulin resistance.MethodsSprague Dawley (SD) rats were randomly divided into four groups:normal diet group (ND group),high-fat diet group (HFD group),high fat diet with Jinlida group (Jinlida group) and high fat diet with pioglitazone group (pioglitazone group),with 6 rats in each group.After 8 weeks,intraperitoneal glucose tolerance test (IPGTT) was performed and area under the curve (AUC) was calculated based on the blood glucose curves;blood glucose and insulin were detected to calculate HOMA-IR;the expression levels of GLUT4 in skeletal muscle were detected by quantitative real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) and Western Blot.ResultsJinlida administration obviously improved 30min,60min blood glucose and AUC during IPGTT,pioglitazone improved significantly 60min,120min blood glucose and AUC (P<0.05),both Jinlida and pioglitazone improved obviously HOMA-IR index (P<0.05),and both of them up-regulated the expression of GLUT4 in skeletal muscle (P<0.05).ConclusionJinlida can up-regulate expression of GLUT4 in skeletal muscle of rats,as a result,which can improve insulin resistance induced by high fat diet.

Jinlida;insulin resistance;skeletal muscle;GLUT4

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.15.006

050017 石家莊市，河北醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院(臧莎莎、劉頤軒)；河北省人民醫(yī)院(宋光耀、王超)

R 587.1

A

1002-7386(2014)15-2259-03

2014-01-14)