高壓氧治療小鼠一氧化碳中毒所致遲發(fā)性腦病的療效及其對病理機制的影響

馮樹行, 王 靜, 顏永紅, 胡懷強, 曹秉振

(1. 第二軍醫(yī)大學濟南軍區(qū)總醫(yī)院, 山東 濟南, 250031; 2. 解放軍第四六三醫(yī)院, 遼寧 沈陽, 110046)

1 材料與方法

1.1 實驗材料

健康C57-6小鼠48只，體質(zhì)量18～24 g, 平均20 g，由山東大學醫(yī)學院實驗動物中心提供。動物飼養(yǎng)于室溫 (24±2) ℃的環(huán)境中，維持光、暗 12 h循環(huán)交替，并給予充足的食料和潔凈飲水。將小鼠隨機分為A、B、C組，A組為空氣對照組8只，B組為CO中毒組20只, C組為CO中毒組20只。

1.2 建造模型

所有小鼠逐個測重、標記，40只小鼠建造CO中毒模型(濟南市氣體廠提供99.9%); A組給予空氣(100 mL/kg)腹腔注射，連續(xù)7 d，作對照；B組給予 CO(100 mL/kg)腹腔注射，連續(xù)7 d; C組給予CO(100 mL/kg)腹腔注射，連續(xù)7 d, 并于CO中毒后0.5 h立即高壓氧治療, DS-II動物實驗加壓泵。純氧大于86%，注意保暖，加壓、減壓各20 min, 治療1 h, 連續(xù)7 d。

中毒癥狀: CO中毒約10 min出現(xiàn)癥狀，萎靡、少動, 0.5 h后，出現(xiàn)口唇、爪、尾巴顏色變紅，呼吸急促、呼吸幅度明顯增大，不活動，聚堆。有的出現(xiàn)輕度的興奮和躁動；再加重表現(xiàn)四肢癱軟無力、行動遲緩；昏迷，大幅度呼吸，頻率減慢，仰臥不動，隨后死亡。高壓氧組中毒0.5 h后，呼吸明顯急促，幅度加大，通過高壓氧治療，癥狀明顯減輕。

1.3 實驗取材

中毒后每天反復(fù)觀察4次以上，時間超過2 h，各組中再次出現(xiàn)活動減少、反應(yīng)遲緩、刺激后躲避差，作為可疑腦病小鼠，盡量平均分配到每次取材中。1周后，B、C組確保1只出現(xiàn)癥狀的小鼠，各共取2只，A組2只，在嚴格的無菌操作下，氯胺酮(1 mg/kg)腹腔注射麻醉，麻醉成功后，俯臥位，打開顱腔，取出腦組織，并分離出一側(cè)大腦、小腦，以及切開脊椎骨，分離暴露出脊髓，剝出脊髓，去掉馬尾與脊膜，同時取小鼠雙側(cè)坐骨神經(jīng)，一同置于4%多聚甲醛以及 2%戊二醛中固定。分別在2周、3周、4周同樣取材，最后進行檢查。

1.4 組織病理染色

石蠟切片的制備: ① 固定。將腦組織、脊髓、坐骨神經(jīng)分別固定于10%中性甲醛緩沖液中24～48 h; ② 脫水。將固定好的組織經(jīng)自來水沖洗30 min后，依次放入75%乙醇4～5 h, 85%乙醇過夜, 90%乙醇2 h, 100%乙醇Ⅰ 1～2 h, 100%乙醇Ⅱ 1 h; ③ 透明。分別置于100%乙醇、二甲苯(1︰1)10 min, 二甲苯Ⅰ 20 min, 二甲苯Ⅱ20 min; ④ 浸蠟。分別置于石蠟Ⅰ(52～54 ℃)10 min, 石蠟Ⅱ(58～60 ℃)15 min, 石蠟Ⅲ(60～62 ℃)60 min; ⑤ 包埋。用熔點為60～62 ℃石蠟包埋，修塊后4 ℃保存; ⑥ 切片、黏片：蠟塊-20 ℃預(yù)冷20 min, 冠狀位切片厚約4 μm, 30%乙醇充分展開臘片, 40～60 ℃溫水中撈片、貼片, 58～60 ℃烤片2 h烘干熔蠟。

1.5 相關(guān)檢查

1.5.1 主要儀器與設(shè)備：光學顯微鏡(日本產(chǎn)OLYMPUS-BX41TF型)，顯微照相設(shè)備(日本產(chǎn)OLYMPUS PM-10AD型)，低溫冰箱(日本產(chǎn)SANYO-MDF19型)，自動脫水機(日本產(chǎn)櫻花TEKVIT型)，組織包埋機 (日本產(chǎn)櫻花TEKTEC型)，石蠟切片機(德國LEICA)，微電腦恒溫恒濕控制箱(德州市瑞科孵化設(shè)備廠)，DK-8D型電熱恒溫水槽(上海森信實驗儀器有限公司)。

1.5.2 主要試劑：HE染色主要試劑為伊紅Y-蘇木素(國藥集團上海化學試劑有限公司); KB染色主要試劑為Solent Blue 38( Alfa Aesar英國)碳酸鋰(國藥集團上?；瘜W試劑有限公司)，Cresyl Violet acetate (焦油紫)(北京索萊寶科技有限公司)；Ed-1染色主要試劑為Ed-1antibody；GFAP染色試劑為GFAP antibody BA0056；MBP染色 試劑為MBP antibody，均來自博士德生物有限公司；免疫組織化學法主要試劑有免疫組化染色試劑盒、檸檬酸鈉抗原修復(fù)液、PBS磷酸緩沖液、濃縮型DAB試劑盒，均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.6 統(tǒng)計學處理

應(yīng)用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析。兩獨立樣本進行t檢驗，率比較采用χ2檢驗。顯著性檢驗水準α=0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

1周內(nèi)B組死亡9只，C組死亡5只; 2周后B組死亡3只，C組死亡1只; 2周后無死亡。A組無死亡。見表1。

表1 各組治療效果比較[n(%)]

病理結(jié)果: HE染色:表現(xiàn)為染毒后1周海馬神經(jīng)元、小腦浦肯野細胞明顯丟失，大腦皮層神經(jīng)元可見到變性丟失，大腦皮層第5層的錐體細胞可見到萎縮嗜伊紅深染。第2～4周皮層神經(jīng)元仍見到變性壞死。高壓氧組，表現(xiàn)相同變化，但程度減輕。第2周GFAP陽性細胞表達,高壓氧組明顯少于中毒組(見圖1); ED-1陽性細胞從染毒第1周即出現(xiàn)，分布的皮層、大腦半球白質(zhì)、小腦及脊髓等組織。第2周開始陽性細胞廣泛見于大腦半球白質(zhì)。但高壓氧組陽性細胞數(shù)量明顯少于單純?nèi)径窘M。脊髓的前外側(cè)區(qū)可見到細胞變性丟失，高壓氧治療組情況要比單純中毒組輕微。小腦顆粒細胞、橋核神經(jīng)元及脊髓前角細胞仍保留良好。MBP標記髓鞘堿性蛋白，從第2周開始可見到大腦半球白質(zhì)結(jié)果染色活性降低，高壓氧組程度輕。 KB染色可見大腦及小腦白質(zhì)結(jié)構(gòu)疏松，存在的髓鞘脫失，但較之單純中毒組，髓鞘損害程度較輕，且膠質(zhì)細胞反應(yīng)略輕微。

圖1 染毒后第2周GFAP陽性細胞表達比較 (GFAP染色 200倍)

3 討 論

一氧化碳中毒[1]是由于在相對密閉的室內(nèi)燃燒取暖、煙囪不通、使用燃氣加熱器淋浴、城市中使用煤氣生活、汽車尾氣、個別自殺等引起。CO與血紅蛋白的親和力較氧和血紅蛋白的親和力要強240倍,但解離速度卻比氧和血紅蛋白的解離速度要慢3 600倍,使氧和血紅蛋白的氧解離曲線左移,阻礙血紅蛋白釋放到組織,導致細胞缺氧。急性CO中毒輕者，脫離環(huán)境到通風地方，吸氧大多好轉(zhuǎn)；重度中毒患者昏迷蘇醒后，經(jīng)過數(shù)日、數(shù)周或2～3個月的清醒期(假愈期)后,又出現(xiàn)神經(jīng)精神癥狀[2], 稱為一氧化碳中毒遲發(fā)性腦病(DEACMP)[3], 癥狀表現(xiàn)為精神異常，包括哭笑無常、行為怪異、人格改變等;智能下降，反應(yīng)遲鈍，言語減少，不會穿衣吃飯等;錐體外系癥狀帕金森癥狀；意識障礙以睜眼昏迷、木僵等為特征,嚴重者呈持續(xù)性植物狀態(tài)；錐體系統(tǒng)癥狀，偏癱、失語，以及尿便障礙植物神經(jīng)癥狀等。個別出現(xiàn)周圍神經(jīng)損害癥狀。CO可直接影響心血管系統(tǒng),中毒程度與吸入CO的濃度和持續(xù)時間密切相關(guān)[4]。DEACMP的損傷部位比較廣泛, 因為中樞神經(jīng)系統(tǒng)對缺氧非常敏感,故腦部最先受累,導致腦細胞水腫和/或細胞間質(zhì)水腫,腦水腫又導致腦循環(huán)障礙,缺血性壞死,廣泛的脫髓鞘病變,導致遲發(fā)性腦病，最常見的病理改變大腦皮層也可出現(xiàn)分層壞死,蒼白球的缺血壞死, 腦白質(zhì)中出現(xiàn)融合、不融合的脫髓鞘斑片; 基底節(jié)區(qū)、海馬區(qū)及小腦有不同程度的病變, 海馬錐體細胞變性壞死消失、小腦神經(jīng)元缺損等; 腦血流出現(xiàn)異常如淤滯、血栓形成和出血等;這些改變可由CT或磁共振成像(MRI)證實[5-6]。

高壓氧(HBO)能加速碳氧血紅蛋白的解離,增強機體組織對一氧化碳的清除,恢復(fù)血紅蛋白攜氧能力,因此血氧分壓越高,碳氧血紅蛋白的解離以及一氧化碳的排除就越快;高壓氧能明顯提高血氧分壓、增加血氧含量,提高血中溶解氧,快速糾正和改善組織中缺氧狀態(tài)；增加ATP, 同時高壓氧也能調(diào)節(jié)腦細胞酶的活性,尤其Na+-K+酶活性，減少細胞內(nèi)Na+減輕腦水腫,減少Ca2+內(nèi)流，減輕繼發(fā)損害，提供了腦組織內(nèi)需氧最佳環(huán)境,使腦神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞在軸索和血管組織相對完好的基礎(chǔ)上得以盡快地修復(fù)和再生[7-9]; 另外，高壓氧有利于大腦神經(jīng)細胞的結(jié)構(gòu)和功能的恢復(fù),因而對DEACMP和后遺癥的防治具有很好的作用。有文獻[10]報道,該病治療總有效率為70.0%～79.5%, 其相關(guān)機制有: ① 通過提高血氧含量，增加組織氧供[11-13]，改善血管通透性，減少滲出和腦水腫; ② 使腦組織局部氧濃度提高、阻止脂質(zhì)過氧化，阻止白細胞向腦微血管內(nèi)皮細胞的黏附，促進失活的細胞色素氧化酶再生; ③提高血管成纖維細胞的分裂、增生，及膠原纖維的形成，促進側(cè)支循環(huán)建立; ④ 降低血黏，減少無氧酵解、血小板聚集等。本研究采用高壓氧治療組小鼠的大腦皮層、基底節(jié)區(qū)、海馬區(qū)、小腦等部位損傷較其他組輕，小膠質(zhì)細胞、膠質(zhì)細胞增生減低，表明高壓氧既能減輕直接損傷，還能減輕了繼發(fā)損傷，對DEACMP有很好的改善作用。臨床上常使用疏血通、丹參或川芎嗪注射液治療，其能改善腦循環(huán)、降低血液黏度、營養(yǎng)神經(jīng)細胞治療[14-15]。在中毒早期同時給予腦活素、奧拉西坦、胞二磷膽堿、三磷酸腺苷、煙酸、維生素C、維生素E等營養(yǎng)神經(jīng)細胞及改善腦代謝藥物，以解除腦水腫和降低顱內(nèi)壓。腦水腫常在急性一氧化碳中毒后2 d達高峰，故及早應(yīng)用高滲脫水劑、大劑量糖皮質(zhì)激素、利尿劑等可促進腦血液循環(huán)，維持呼吸循環(huán)功能，有助于防治腦水腫[16]。自由基清除劑、鈣通道拮抗劑、鈣超載及自由基所引發(fā)的脂質(zhì)過氧化作用均參與了腦組織損傷的過程。因此，在急性中毒早期給予維生素C、維生素E、超氧化物歧化酶等抗氧化劑及自由基清除劑依達拉奉治療有助于防治DEACMP。鈣通道拮抗劑尼莫地平對缺血性腦損傷有良好的保護作用，有研究[17-18]發(fā)現(xiàn)尼莫地平能顯著降低一氧化碳中毒小鼠急性期病死率和總病死率，并改善中毒所致的學習記憶能力的損傷，避免海馬神經(jīng)元延遲性死亡，阻遏單胺氧化酶活性的異常升高。

DEACMP的病程較長，常伴有精神和錐體外系癥狀，積極合理的臨床治療有助于縮短病程，改善預(yù)后[19-22]。對頻繁抽搐、極度煩躁不安者對癥，給予安定等抗驚劑; 肌張力增高者使用安坦、美多巴等。積極治療并發(fā)癥，防治感染，充分休息，避免各種精神刺激和意外事件的發(fā)生[23-25]。

[1] 岳穎, 金軍, 劉建衛(wèi), 等. 急性一氧化碳中毒急救的研究進展[J]. 中國中醫(yī)急癥, 2012, 21(4): 60.

[2] 胡浩. 依達拉奉聯(lián)合高壓氧治療急性一氧化碳中毒遲發(fā)性腦病30例分析[J]. 中國實用神經(jīng)疾病雜志, 2010, 13(1): 67.

[3] 易露. 高壓氧治療急性一氧化碳中毒遲發(fā)性腦病的臨床療效觀察[J]. 醫(yī)學理論與實踐, 2014, 27(2): 187.

[4] 王承輝. 甘露醇對一氧化碳中毒患者近期癥狀的影響[J].中華實用診斷與治療雜志, 2009, 23(1): 71.

[5] 何家禮. 高壓氧聯(lián)合藥物治療重度急性一氧化碳中毒臨床觀察[J]. 臨床薈萃, 2010, 25(24): 2169.

[6] 許羅俊, 周樹榮, 唐音, 等. 高壓氧對重度一氧化碳中毒休克的促醒作用[J]. 中國臨床康復(fù), 2003, 9(5): 3535.

[7] 葉任高, 陸再英. 內(nèi)科學[M]. 6版. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2004: 973.

[8] 張建宏,劉金平,常勇霞,等.高壓氧治療一氧化碳中毒遲發(fā)性腦病的療效觀察[J].中國實用神經(jīng)疾病雜志, 2006, 9(6): 150.

[9] 張樹新. 高壓氧治療對一氧化碳中毒遲發(fā)性腦病患者的影響[J]. 中華航海醫(yī)學與高氣壓醫(yī)學雜志, 2011, 18(4): 239.

[10] 楊廷芳, 任主軍, 郝強, 等. 一氧化碳中毒后遲發(fā)性腦病的病程及預(yù)后[J]. 卒中與神經(jīng)疾病, 2007, 14: 220.

[11] 甄君, 王雪晴, 耿建紅, 等. 高壓氧聯(lián)合運動療法對腦梗死功能恢復(fù)的影響[J]. 中華全科醫(yī)學, 2011, 9(9): 1348.

[12] 潘銳, 唐亞梅, 容小明等. 一氧化碳中毒遲發(fā)性腦病臨床特征及危險因素分析[J]. 中國實用內(nèi)科雜志, 2012, 32(10): 787.

[13] 龍霄翱, 梁遠生, 陳兵, 等. 微創(chuàng)血腫清除術(shù)后高壓氧聯(lián)合依達拉奉治療高血壓腦出血療效觀察[J]. 中華全科醫(yī)學, 2011, 9(7): 1022.

[14] 肖端, 呂田明, 陸兵勛, 等. 半結(jié)扎腦表面動脈構(gòu)建大鼠局灶性淋巴滯留性腦病動物模型[J]. 南方醫(yī)科大學學報, 2011, 31(1): 125.

[15] 朱瑞昉. 高壓氧聯(lián)合藥物治療急性腦梗死療效觀察[J]. 中華全科醫(yī)學, 2011, 9(9): 1394.

[16] 尹素梅. 氣管切開患者行高壓氧治療時的陪艙護理體會[J]. 中華全科醫(yī)學, 2011, 9(2): 323.

[17] 楊俊卿, 周歧新. 尼莫地平對一氧化碳中毒致小鼠腦損傷保護作用研究[J]. 工業(yè)衛(wèi)生與職業(yè)病, 2001, 27(1): 19.

[18] 戴瑛, 吳祖舜. 腦出血大鼠局部血流量的改變及尼莫地平的干預(yù)作用[J]. 臨床神經(jīng)病學雜志, 2008, 21(1): 49.

[19] 甄君, 王雪晴, 耿建紅, 等. 高壓氧聯(lián)合運動療法對腦梗死功能恢復(fù)的影響[J]. 中華全科醫(yī)學, 2011, 9(9): 1348.

[20] 尹素梅. 氣管切開患者行高壓氧治療時的陪艙護理體會[J]. 中華全科醫(yī)學, 2011, 9(2): 323.

[21] 龍霄翱, 梁遠生, 陳兵, 等. 微創(chuàng)血腫清除術(shù)后高壓氧聯(lián)合依達拉奉治療高血壓腦出血療效觀察[J]. 中華全科醫(yī)學, 2011, 9(7): 1022.

[22] 潘銳, 唐亞梅, 容小明, 等. 一氧化碳中毒遲發(fā)性腦病臨床特征及危險因素分析[J]. 中國實用內(nèi)科雜志, 2012, 32(10): 787.

[23] 龍霄翱, 梁遠生, 陳兵, 等. 微創(chuàng)血腫清除術(shù)后高壓氧聯(lián)合依達拉奉治療高血壓腦出血療效觀察[J]. 中華全科醫(yī)學, 2011, 9(7): 1022.

[24] 朱瑞昉. 高壓氧聯(lián)合藥物治療急性腦梗死療效觀察[J]. 中華全科醫(yī)學, 2011, 9(9): 1394.

[25] 肖端, 呂田明, 陸兵勛, 等. 半結(jié)扎腦表面動脈構(gòu)建大鼠局灶性淋巴滯留性腦病動物模型[J]. 南方醫(yī)科大學學報, 2011, 31 (1): 125.