5-甲基胞嘧啶鎖核酸的合成新方法*

顧 問(wèn)，陳 貝，葛 敏

(南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院 材料化學(xué)工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210009)

·研究簡(jiǎn)報(bào)·

5-甲基胞嘧啶鎖核酸的合成新方法*

顧 問(wèn)，陳 貝，葛 敏

(南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院 材料化學(xué)工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210009)

設(shè)計(jì)了一種新的合成5-甲基胞嘧啶鎖核酸{(1R,3R,4R,7S)-3-[(5-甲基-4-N-苯甲酰基胞嘧啶-1-基)-7-(2-氰基乙氧基)-(N,N-二異丙基)膦氧代]-1-(4,4′-二甲氧基三苯代甲基氧基甲基)-2,5-二氧雜二環(huán)-[2.2.1]庚烷(1)}的方法。以3-芐氧基-4-C-羥甲基-1,2-O-異亞丙基-α-D-呋喃核糖為起始原料，經(jīng)取代、水解等12步反應(yīng)合成了1，總收率21.0%，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR和MS確證。

鎖核酸；呋喃核糖；胞嘧啶;合成

鎖核酸(LNA)是一種經(jīng)過(guò)修飾的核糖核酸類寡核苷酸衍生物，結(jié)構(gòu)中腺嘌呤、胞嘧啶、鳥(niǎo)嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶和5-甲基胞嘧啶六種堿基核糖的2′-O，4′-C位通過(guò)縮水作用形成剛性結(jié)構(gòu)[1]。與其他寡核苷酸類似物相比，LNA具有很好的熱穩(wěn)定性、水溶性及體內(nèi)無(wú)毒副作用等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于基因診斷、基因治療、PCR等技術(shù)中[2-3]。LNA中六種堿基磷酸鹽核糖是其重要組成部分，其中β型5-甲基胞嘧啶鎖核酸單體的合成方法鮮有報(bào)道。Alexei A Koshkin小組[4]以3-芐氧基-4-C-羥甲基-1,2-O-異亞丙基-α-D-呋喃核糖(2)[5]為原料，經(jīng)取代、縮合、水解等8步反應(yīng)先合成胸腺嘧啶呋喃核糖中間體，再經(jīng)1,2，4-三氮唑取代、水解將胸腺嘧啶轉(zhuǎn)換為5-甲基胞嘧啶鎖核酸{(1R,3R,4R,7S)-3-[(5-甲基-4-N-苯甲?；奏?1-基)-7-(2-氰基乙氧基)-(N,N-二異丙基)膦氧代]-1-(4,4′-二甲氧基三苯代甲基氧基甲基)-2,5-二氧雜二環(huán)-[2.2.1]庚烷(1)}，共經(jīng)15步反應(yīng)，總收率7.50%。該合成方法路線較長(zhǎng)，收率較低。

本文對(duì)1的合成進(jìn)行了探索和研究。對(duì)文獻(xiàn)[4]方法加以改進(jìn)，設(shè)計(jì)了一種新的合成1的方法。以2為起始原料，經(jīng)取代、水解等12步反應(yīng)合成了1(Scheme 1)，總收率21.0%，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR和MS確證。

該方法采用三氟甲磺酸三甲基硅酯(TMSOTf)催化縮合[6]將4-N-苯甲酰氨基-5-甲基胞嘧啶(5)引入到目標(biāo)化合物中，將反應(yīng)路線的線性步數(shù)由15步減少至12步，同時(shí)改進(jìn)了合成工藝，總收率從7.50%提高至21.0%，并使該路線更適合于合成其它不同堿基取代的核糖衍生物。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1．1 儀器與試劑

Bruker DRX300/500MHz型核磁共振儀(CDCl3為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo))；Agilent 1100型LC/MS液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀。

所用試劑均為分析純。

1．2 合成

(1)3-O-苯甲基-4-C-甲基磺氧基甲基-5-O-甲磺酰-1,2-O-異亞丙基-α-D-呋喃核糖(3)的合成[5]

在反應(yīng)瓶中加入215.0g(48.6mmol)和吡啶72.0mL，冰水浴冷卻，攪拌下緩慢滴加甲磺酰氯(MsCl)14.9g(130mmol)，滴畢，于室溫反應(yīng)1h(TLC跟蹤)。減壓蒸除溶劑，加水(300mL)稀釋，用二氯甲烷(2×100mL)萃取，合并萃取液，用飽和氯化鈉溶液洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，旋蒸脫溶得黃色油狀液體318.6g，收率82%;1H NMRδ：7.26～7.36(m，5H)，5.79(d，J=7.3Hz，1H)，4.75～4.89(m，2H)，4.63～4.66(m，1H)，4.55～4.58(s，1H)，4.30～4.43(m，2H)，4.13～4.20(m，2H)，3.08(s，3H)，2.98(s，3H)，1.68(s，3H)，1.34(s，3H)。

(2)1,2-二-O-乙?；?3-O-苯甲基-4-C-甲基磺氧基甲基-5-O-甲磺酰-D-呋喃核糖(4)的合成

在反應(yīng)瓶中加入318.0g(39.0mmol)，冰水浴冷卻，攪拌下緩慢滴加80%三氟乙酸(TFA)溶液(113mL)，滴畢，于室溫反應(yīng)1h(TLC跟蹤)。用飽和碳酸鈉溶液調(diào)pH至7～8，用二氯甲烷(2×100mL)萃取,合并萃取液，用飽和氯化鈉溶液洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥得油狀液體中間體M。加入乙酸酐11.9g (0.117mol)和吡啶39mL，攪拌下于室溫反應(yīng)16h(TLC跟蹤)。旋蒸除溶，殘留物加水200mL，用乙酸乙酯(2×80mL)萃取，合并萃取液，用飽和氯化鈉溶液洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，濃縮得棕色油狀液體418.7g，收率94%;1H NMRδ：7.26～7.37(m，5H)，5.38(s，1H)，4.59～4.63(m，1H)，4.47～4.53(m，2H)，4.39～4.42(m，2H)，4.27～4.33(m，2H)，4.15～4.25(m，1H)，3.00～3.02(m，6H)，2.14(s，3H)，2.08(s，3H)。

由于 PCS9000數(shù)據(jù)庫(kù)中設(shè)備類表的關(guān)鍵字為自動(dòng)生成，如果兩個(gè)系統(tǒng)同時(shí)修改模型數(shù)據(jù)就有可能會(huì)出現(xiàn)同一關(guān)鍵字所對(duì)應(yīng)的設(shè)備不同的情況，從而造成兩個(gè)系統(tǒng)模型數(shù)據(jù)的混亂，因此維護(hù)操作只能在其中一個(gè)系統(tǒng)進(jìn)行。同時(shí)，當(dāng)網(wǎng)絡(luò)不通或者備用系統(tǒng)服務(wù)器發(fā)生故障時(shí)，主系統(tǒng)題，應(yīng)將修改信息保存在本地機(jī)器上，等故障排除后，再將保存的信息發(fā)送給備用系統(tǒng)，用系統(tǒng)數(shù)據(jù)服務(wù)器執(zhí)行修改操作，從而實(shí)現(xiàn)兩系統(tǒng)之間圖形和數(shù)據(jù)庫(kù)的同步

(3)1-(2-O-乙酰基-3-O-苯甲基-4-C-甲基磺氧基甲基-β-D-呋喃核糖基)-4-N-苯甲酰氨基-5-甲基胞嘧啶(6)的合成[6]

在反應(yīng)瓶中加入480.0g(157mmol)，乙腈1.65L，554.0g(235mmol)，N,O-雙(三甲硅基)乙酰胺144mL(235mmol)，攪拌下回流反應(yīng)至反應(yīng)液變澄清。冰水浴冷卻，滴加TMSOTf 61.0mL(313mmol)，滴畢，回流反應(yīng)過(guò)夜(TLC跟蹤)。減壓蒸除溶劑，殘留物加水(1.5L)稀釋，用二氯甲烷(2×500mL)萃取，合并萃取液，依次用碳酸氫鈉溶液、飽和氯化鈉溶液洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，濃縮得黃色固體6104.0g，收率97.6%;1H NMRδ：13.21(s，1H)，8.29(t，J=8.1Hz，2H)，7.23～ 7.56(m，9H)，5，73(s，1H)，5.56～5.74(m，1H)，4.69(d，J=6.6Hz，1H)，4.34～4.63(m，6H)，3.11(s，3H)，3.00(d，J=7.8Hz，3H)，2.17(s，3H)，2.11(s，3H)，2.04(s，3H)；ESI-MSm/z: 680.6{[M+H]+}。

(4)(1S,3R,4R,7S)-7-芐氧基-1-甲基磺氧基甲基-3-(5-甲基-4-N-苯甲?；奏?1-基)-2,5-二氧雜二環(huán)-[2.2.1]庚烷(7)合成

在反應(yīng)瓶中加入660.0g(88.6mmol)，1，4-二氧六環(huán)750mL和1mol·L-1氫氧化鈉溶液(750mL)，攪拌下于室溫反應(yīng)1h(TLC跟蹤)。用二氯甲烷(3×500mL)萃取，合并萃取液，用無(wú)水硫酸鈉干燥，濃縮得黃色固體747.0g，收率99%;1H NMRδ：13.35(s，1H)，8.31(t，J=7.2Hz，2H)，7.26～7.59(m，9H)，5.71(s，1H)，4.52～4.75(m，8H)，3.09(s，3H)，2.12(s，3H)；ESI-MSm/z: 542.5{[M+H]+}。

(5)(1S,3R,4R,7S)-7-芐氧基-1-苯甲酰氧基甲基-3-(5-甲基-4-N-苯甲?；奏?1-基)-2,5-二氧雜二環(huán)-[2.2.1]庚烷(8)的合成

在反應(yīng)瓶中加入747.0g(88.5mmol)，DMF 441mL，苯甲酸鈉 23.0g(160mmol)，攪拌下于90℃反應(yīng)過(guò)夜(TLC跟蹤)。加水(1.2L)稀釋，用二氯甲烷(3×500mL)萃取，合并萃取液，用無(wú)水硫酸鈉干燥，濃縮，殘留物加甲醇1L(析出固體),抽濾,濾餅真空干燥得白色固體831g，收率62%;1H NMRδ：8.28(t，J=8.5Hz，2H)，7.97(t，J=9.0Hz，2H)，7.61～7.65(m，2H)，7.44～7.55(m，5H)，7.25～7.49(m，5H)，5.62(s，1H)，4.85(d，J=12.5Hz，1H)，4.71(d，J=12.5Hz，2H )，4.52(d，J=12.5Hz，2H)，4.19(d，J=12.0Hz，1H)，3.98(d，J=8.0Hz，1H)，3.98(s，1H)，1.80(s，3H)；ESI-MSm/z: 568.6{[M+H]+}。

(6)(1S,3R,4R,7S)-7-芐氧基-1-羥甲基-3-(5-甲基-4-N-苯甲?；奏?1-基)-2,5-二氧雜二環(huán)-[2.2.1]庚烷(9)的合成

在反應(yīng)瓶中依次加入868.0g(119mmol)，1，4-二氧六環(huán)(1L)，1mol·L-1NaOH溶液1L，攪拌下于室溫反應(yīng)0.5h(TLC跟蹤)。用2mol·L-1鹽酸調(diào)pH至6，用二氯甲烷(3×500mL)萃取,合并萃取液，用飽和氯化鈉溶液洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓濃縮，殘余物用混合溶劑[A=V(EA)∶V(PE)=5∶95]500mL分散，抽濾，濾餅真空干燥得白色固體952.0g，收率94.5%;1H NMRδ：8.30(t，J=7.5Hz，2H)，7.70(s，1H)，7.46(t，J=14.5Hz，1H)，7.25～7.55(m，7H)，5.70(s，1H)，4.66(d，J=12.0Hz，1H)，4.58(s，1H)，4.54(d，J=12.0Hz，1H)，3.95～4.05(m，4H)，3.83(d，J=8Hz，1H)，2.15(s，3H)；ESI-MSm/z: 464.5{[M+H]+}。

在反應(yīng)瓶中依次加入940.0g(86.6mmol)，甲醇254mL，鈀碳4.0g及甲酸銨16.3g(259mol)，攪拌下回流反應(yīng)2h(TLC跟蹤)。用硅藻土過(guò)濾，濾餅用甲醇多次沖洗，合并濾液和洗液，濃縮得白色固體1021.1g，收率91%;1H NMRδ：7.55(s，1H)，7.29(s，1H)，6.79(s，1H)，5.58(s，H)，5.36(s，1H)，5.15(s，1H)，4.04(s，1H)，3.73～3.81(m，3H)，3.61(s，1H)，2.06(s，3H)；ESI-MSm/z: 270.4{[M+H]+}。

(8)(1R,3R,4R,7S)-3-(5-甲基胞嘧啶-1-基)-1-(4,4′-二甲氧基三苯代甲基氧代甲基)-7-羥基-2,5-二氧雜二環(huán)-[2.2.1]庚烷(11)的合成

在反應(yīng)瓶中加入1024.0g(89.6mmol)，氮?dú)獗Ｗo(hù)下加入無(wú)水吡啶180mL，4,4′二甲氧基三苯基氯甲烷(DMTCl)30.2g(89.5mol)，攪拌下于室溫反應(yīng)4h(TLC跟蹤)。加水(200mL)稀釋，用乙酸乙酯(100mL)萃取，有機(jī)相用水(3×200mL)洗滌，濃縮后經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑：A=2∶8)純化得白色固體1138g，收率75%;1H NMRδ：6.88～7.49(m，14H)，6.88(s，1H)，5.67(d，J=3.0Hz，1H)，5.39(s，1H)，3.97～4.11(m，2H)，3.28～3.40(m，10H)，1.96(s，3H)；ESI-MSm/z: 572.6{[M+H]+}。

(9)(1R,3R,4R,7S)-7-(三甲基甲硅烷基氧基)-3-(5-甲基-4-N-苯甲?；奏?1-基)-1-(4,4′-二甲氧基三苯代甲基氧代甲基)-2,5-二氧雜二環(huán)-[2.2.1]庚烷(12)的合成

在反應(yīng)瓶中加入1110.0g(17.5mmol)，氮?dú)獗Ｗo(hù)下加入無(wú)水吡啶87.5mL，三乙胺24.5mL和三甲基氯硅烷(TMSCl)3.5mL ，攪拌下于室溫反應(yīng)1h(TLC跟蹤)；加入苯甲酰氯2.2mL，于室溫反應(yīng)1h(TLC跟蹤)。倒入200mL冰水中，用乙酸乙酯(2×50mL)萃取，合并萃取液，依次用水和飽和氯化鈉溶液洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，濃縮得淡黃色固體12粗品14.0g，收率107%，直接用于下步反應(yīng)；ESI-MSm/z: 748.8{[M+H]+}。

(10)(1R,3R,4R,7S)-3-(5-甲基-4-N-苯甲?；奏?1-基)-1-(4,4′-二甲氧基三苯代甲基氧代甲基)-7-羥基-2,5-二氧雜二環(huán)-[2.2.1]庚烷(13)的合成

在反應(yīng)瓶中依次加入1213.0g(17.4mmol)，THF 87.0mL，1mol·L-1四丁基氟化銨(TBAF)的THF(6.0mL)溶液，攪拌下于室溫反應(yīng)0.5h(TLC跟蹤)。加水(100mL)稀釋，用二氯甲烷(50mL)萃取，有機(jī)相依次用碳酸氫鈉溶液和飽和氯化鈉溶液洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，濃縮后經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑：A=4∶6)純化得白色固體1310.3g，收率88%;1H NMRδ：13.42(s，1H)，8.29(d，J=6.0Hz，2H)，7.82(s，1H)，7.26～7.53(m，12H)，6.88(m，4H)，5.71(s，1H)，4.47(s，1H)，4.27(s，1H)，4.00～4.10(m，2H)，3.80～3.83(m，2H)，3.80(s，6H)，3.59(d，J=11.4Hz，1H)，3.46(d，J=14.1Hz，1H)，1.89(s，3H)；ESI-MSm/z: 676.7{[M+H]+}。

(11)1的合成[7]

在反應(yīng)瓶中依次加入1310.0g(14.8mmol)，二氯甲烷74mL，氮?dú)獗Ｗo(hù)下加入N，N-二異丙基乙胺1.91g(14.8mmol)，緩慢滴加入(二異丙基氨基)(2-氰基乙氧基)氯化磷4.7mL，攪拌下于室溫反應(yīng)8h(TLC跟蹤)。加水(50mL)稀釋，用二氯甲烷(2×50mL)萃取，合并萃取液，依次用碳酸氫鈉溶液和飽和氯化鈉溶液洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，濃縮后經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑：A=3∶7)純化得白色粉末110.5g，收率81%;1H NMRδ：12.38(s，1H)，8.16(s，2H)，7.86(s，1H)，7.27～7.58(m，12H)，6.89～6.94(m，4H)，5.62(s，1H)，4.49(s，1H)，4.43(d，J=8.7Hz，1H)，4.01(d，J=7.2Hz，1H)，3.81(d，J=8.1Hz，1H)，3.74(s，6H)，3.44(s，5H)，2.71(d，J=10Hz，1H)，2.60(d,J=8．0Hz,1H)，1.98(s，3H)，1.19～1.3(m，11H)；ESI-MSm/z: 876.8{[M+H]+}。

2 結(jié)果與討論

在合成6和8時(shí)，需嚴(yán)格控制氫氧化鈉水解的溫度和時(shí)間，溫度過(guò)高或水解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，均會(huì)引起胸腺嘧啶核糖副產(chǎn)物的生成。

在11至13的合成過(guò)程中，文獻(xiàn)方法采用將11先用TMSCl保護(hù)，再與苯甲酰氯進(jìn)行反應(yīng)，最后用氨水脫去三甲基硅烷，三步總收率38%。在重復(fù)該方法的實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)氨水在脫去三甲基硅烷的同時(shí)水解掉了苯甲?；?，導(dǎo)致收率降低。為此本文將11先用TMSCl進(jìn)行保護(hù)，再與苯甲酰氯反應(yīng)得12，最后用TBAF選擇性脫去三甲基硅烷得合成13，三步總收率由38%提高至88%。

本文設(shè)計(jì)了一條新的合成5-甲基胞嘧啶磷酸核糖的路線。與原工藝相比，縮短了合成路線，總收率從7.50%提高至21.0%。

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ANewSyntheticMethodof5-MethylcytosineLockedNucleicAcid

GU Wen, CHEN Bei, GE Min

(State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering,College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering,Nanjing University of Technology,Nanjing 210009,China)

A new synthetic route of 5-methylcytosine LNA{(1R,3R,4R,7S)-7-[2-cyanoethoxy(diisopropylamino)phosphinoxy]-l-(4,4′-dimethoxytrityloxymethyi)-3-(5-methyl-4-N-benzoylcytosine-l-yl)-2,5-dioxabicyclo[2.2.1]heptan (1)} was developed.1with the total yield of 21.0% was synthesized by a twelve-step reaction of substitution reaction and hydrolysis reaction,etc,using furanose 3-O-benzyl-4-C-hydroxymethyl-1,2-O-isopropylidene-α-D-ribofuranose as the starting material.The structure was confirmed by1H NMR and MS.

LNA;ribofuranose;cytosine;synthesis

2013-06-20；

2014-06-06

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(21072094/B0206)

顧問(wèn)(1988-),男，漢族，江蘇淮安人，碩士研究生，主要從事藥物及藥物中間體的合成研究。

葛敏,博士，教授，E-mail: minge88@gmail.com

O626.4；O629.1

A

1005-1511(2014)01-0668-04