慢性阻塞性肺疾病中MMP-9/TIMP-1與Th17/Treg作用與聯(lián)系

康彩云 吳世滿 劉曉君 劉 娟

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)是一種慢性呼吸系統(tǒng)疾病，是慢性支氣管炎和肺氣腫患者出現(xiàn)肺功能檢查氣流受限、不完全可逆時(shí)的一種疾病。COPD是可以預(yù)防和可以治療的常見疾病[1]。COPD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜多樣，具體機(jī)制仍未清楚，缺乏有效的防治方法，因而發(fā)病率及病死率均較高。研究發(fā)現(xiàn)除了一些公認(rèn)的發(fā)病機(jī)制外，自體免疫與COPD發(fā)病也存在較為密切的關(guān)系[2]。COPD再也不能被認(rèn)為是一種只涉及肺的疾病，系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)的后果使它成為其他慢性并發(fā)癥的重要危險(xiǎn)因素[3]。本研究選取COPD急性加重期、COPD穩(wěn)定期作為研究對象，健康吸煙肺功能正常，健康非吸煙肺功能正常者為對照組，分別抽血外周靜脈血，提取外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)，用流式細(xì)胞儀檢測各組Th17、Treg細(xì)胞分化水平，對各組間Th17、Treg分化水平進(jìn)行比較，用酶聯(lián)免疫吸附法測定血漿中MMP-9和其抑制物TIMP-1含量，比較各組間MMP9、TIMP-1含量差異，并對MMP-9、TIMP-1含量與Th17、Treg分化水平相關(guān)性進(jìn)行分析，旨在了解MMP-9/TIMP-1與Th17/Treg細(xì)胞在COPD自體免疫中的作用機(jī)制及其相互聯(lián)系。

資料和方法

一、研究資料

1. 研究對象： 搜集2013年3月至2013年12月來山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科就診的慢性阻塞性肺疾病患者55例，均符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)慢性阻塞性肺疾病學(xué)組編寫的《慢性阻塞性肺疾病診治指南(2007年修訂版)》診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]。其中COPD急性加重期患者30例，男22例，女8例，年齡50歲～73歲，平均年齡64.00歲；COPD穩(wěn)定期25例，男19例，女6例，年齡46～75歲，平均年齡61.26歲。所有患者除外支氣管哮喘、支氣管擴(kuò)張、肺間質(zhì)纖維化、冠狀動(dòng)脈性心臟病、風(fēng)濕免疫性疾病及其他自身免疫性疾病病史。 肺功能正常組40例，為同期我院門診健康體檢者。健康吸煙肺功能正常組20例，男14例，女6例，年齡46～75歲，平均年齡59.25歲；健康非吸煙肺功能正常組20例，男13例，女7例，年齡46～75歲，平均年齡62.90歲。吸煙者為大于或等于10包/年。所有研究對象均知情同意，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

2. 主要試劑及儀器： 混合單克隆抗體R-PE IL-17A、Alexa Fluor 647 Foxp3、FITC CD4，刺激劑、細(xì)胞固定液、細(xì)胞破膜液均購自美國Becton Dickinson公司。人基質(zhì)金屬蛋白酶9 ELISA 試劑盒、人基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子-1 ELISA試劑盒購自武漢博士德生物公司。 流式細(xì)胞分析儀(美國Becton Dickinson公司)，CO2培養(yǎng)箱(美國NAPCO公司)，超凈工作臺(蘇州安泰)，酶標(biāo)儀(美國寶特800)

二、研究方法

1. 搜集血漿和分離單個(gè)核細(xì)胞懸液： 全部研究者均于清晨留取空腹靜脈血5 ml，置于肝素鈉抗凝管中，以離心半徑8 cm，2000 r/min，離心10 min，取血漿分裝于EP管中-80 ℃凍存。取血漿后的血細(xì)胞用磷酸緩沖液(phosphate buffer solution, PBS)重懸，在離心管中加入3 ml淋巴細(xì)胞分離液，重懸血細(xì)胞加入淋巴細(xì)胞分離液上層，以離心半徑8 cm，2500 r/min，離心20 min，分離后吸取單個(gè)核細(xì)胞層于另一離心管中，用PBS洗滌一次，即可得到單個(gè)核細(xì)胞懸液。

2. 流式細(xì)胞術(shù)檢測Th17、CD4+Treg細(xì)胞： 制備得到單個(gè)核細(xì)胞懸液置于24孔培養(yǎng)板，加入1 ml 1640培養(yǎng)基和2 μl刺激劑在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育4～6 h，按照試劑盒說明加入抗體，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測。

3. 血漿MMP9、TIMP-1 的測定： 采用酶聯(lián)免疫吸附法測定血漿中MMP9、TIMP-1的含量，按照試劑盒說明書操作，用酶標(biāo)儀450 nm測定OD值。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、一般情況

各組性別、年齡比例比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.736，P>0.05；F=1.215，P>0.05。肺功能指標(biāo)比較：COPD急性加重期組存在明顯氣流受限，與健康吸煙組和健康不吸煙組比較，F(xiàn)EV1% pred、FEV1/FVC差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與COPD緩解期組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但急性期組氣流受限更明顯；COPD緩解期與健康吸煙組和健康不吸煙組比較，F(xiàn)EV1% pred、FEV1/FVC差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);健康吸煙組與健康不吸煙組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但健康吸煙組FEV1/FVC、FEV1%pred較不吸煙肺功能正常組有所下降，見表1。

二、各組外周血Th17、Treg細(xì)胞占CD4+細(xì)胞的比例和Th17/Treg的比值的比較

外周血Th17/CD4+T(%)比較：COPD急性期組高于緩解組、健康非吸煙組、健康吸煙組(F=22.264，P<0.05)；COPD緩解期組與健康吸煙組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與健康非吸煙組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；健康吸煙組與健康非吸煙組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

外周血Treg/CD4+T(%)比較：各組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.971，P>0.05)。

表2 各組外周血Th17、Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例和Th17/Treg的比值比較

Th17/Treg比值的比較：COPD急性加重期組顯著高于COPD緩解期組、健康吸煙組、健康非吸煙組(F=15.029,P<0.05)；COPD緩解期組與健康吸煙組、健康非吸煙組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；健康吸煙組與健康非吸煙組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

三、各組血漿MMP-9、TIMP-1 濃度、MMP-9/TIMP-1比值的比較

1. 血漿中MMP-9含量的比較：COPD急性加重期組顯著高于COPD緩解期組、健康吸煙組、健康非吸煙組(F=171.545，P<0.01)；COPD緩解期組與健康吸煙組、健康非吸煙組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),健康吸煙組與健康非吸煙組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

2. 血漿中TIMP-1含量的比較：COPD急性加重期組含量顯著高于其他三組(F=5.420，P<0.05)；COPD緩解期組與健康吸煙組、健康非吸煙組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；健康吸煙組與健康非吸煙組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但健康吸煙組比較相對略高。

表1 研究對象的一般情況

3. 血漿中MMP-9/TIMP-1比值的比較：各組相比，整體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，(F=15.029，P<0.01),COPD急性加重期組與其他三組相比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；COPD緩解期組與健康組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；健康吸煙組與健康非吸煙組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但健康吸煙組其比值相對較高，見表3。

表3 各組血漿中MMP-9、TIMP-1含量和MMP-9/TIMP-1的比值比較

四、各組MMP9、TIMP-1/MMP-9/TIMP-1與Th17/CD4+ T(%)、Treg/CD4+ T(%)、Th17/Treg相關(guān)性

COPD急性加重期組、COPD緩解期組MMP-9與Th17/CD4+T(%)存在相關(guān)性(r值0.376，P<0.05/r值0.459，P<0.05)。健康吸煙組和健康非吸煙組均無相關(guān)性。TIMP-1與Treg/CD4+T(%)之間，MMP-9/TIMP-1比值與Th17/Treg比值之間，MMP-9與Th17/Treg比值間，在各組均無相關(guān)性。

討 論

近年來研究發(fā)現(xiàn)COPD發(fā)生機(jī)制是多種因素共同作用的結(jié)果，其中MMP-9和TIMP-1平衡失調(diào)即MMP-9/TIMP-1比值的變化在COPD發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[4]。研究發(fā)現(xiàn)Th17和Treg平衡失調(diào)在COPD的發(fā)生發(fā)展有重要作用[5-6]。本研究對這兩種發(fā)病機(jī)制的特點(diǎn)及相關(guān)關(guān)系進(jìn)行了研究。

MMP-9是細(xì)胞外基質(zhì)降解的主要蛋白酶，主要通過金屬鋅或鈣離子介導(dǎo)引起肺泡壁細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的損傷和降解，破壞正常的肺泡結(jié)構(gòu)，引起肺泡腔的擴(kuò)大，參與氣道重構(gòu)而導(dǎo)致氣道阻塞。TIMP-1是MMP-9的天然抑制因子，主要通過抑制MMP-9活性，在肺泡壁細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用[7]。本研究中COPD急性期組MMP-9含量、TIMP-1含量及MMP-9/TIMP-1比值均明顯增高，提示其參與了COPD急性期肺組織進(jìn)一步損傷，使患者局部和全身炎癥反應(yīng)加重，表現(xiàn)為咳嗽、咳痰癥狀加重及呼吸困難明顯、全身乏力、心律失常、電解質(zhì)紊亂等并發(fā)癥。COPD穩(wěn)定期組與健康組對比MMP-9、TIMP-1、MMP-9/TIMP-1比值亦有所增高，所以穩(wěn)定期患者也存在長期慢性咳嗽、咳痰癥狀及活動(dòng)后氣短癥狀。另外，MMP-9、TIMP-1含量及TIMP-1比值較健康組增高，提示其可能也參與了肺結(jié)構(gòu)的慢性破壞和重塑，并使氣道杯狀細(xì)胞的增生、化生和黏液增加，導(dǎo)致氣道慢性炎癥和肺氣腫，使肺功能指標(biāo)逐年下降，引起長期的慢性咳嗽、咳痰、呼吸困難等癥狀。正常情況下肺組織不表達(dá)或僅表達(dá)微量的MMP-9，但在各種刺激下，肺的實(shí)質(zhì)細(xì)胞如支氣管上皮細(xì)胞、Ⅱ型肺泡細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞和肺的各種炎性細(xì)胞如中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞及自然殺傷細(xì)胞與樹突狀細(xì)胞等均能產(chǎn)生MMP-9[8-9]。健康吸煙者由于長期煙草煙霧的刺激，其MMP-9、TIMP-1含量有所增加，可能長期存在氣道損傷和重塑，所以吸煙是慢性阻塞性肺疾病的重要危險(xiǎn)因素。

本研究發(fā)現(xiàn)COPD急性加重期與緩解期組、健康吸煙、健康不吸煙組比較，Th17占CD4+T淋巴細(xì)胞比例增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Treg與其他各組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但較健康對照組有所增加。Th17/Treg比值較緩解期組、健康對照組增高，存在平衡失調(diào)。COPD緩解期組Th17、Treg均增高，但是Thl7/Treg尚處于平衡狀態(tài)。健康吸煙組Th17比例已有所增高，可能由于煙草煙霧及香煙有害物能損傷氣道，釋放自身抗原物質(zhì)激發(fā)自體免疫反應(yīng)。Th17細(xì)胞是新發(fā)現(xiàn)的輔助性T細(xì)胞，因其特異性的分泌IL-17而得名。Thl7細(xì)胞在肺內(nèi)高表達(dá)可能是導(dǎo)致煙草煙霧暴露小鼠肺內(nèi)慢性炎癥反應(yīng)持續(xù)的原因之一，戒煙是能夠延緩COPD患者肺功能進(jìn)行性下降的有效措施之一[10]。Treg細(xì)胞是一群具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)的淋巴細(xì)胞，是重要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，能保持免疫系統(tǒng)的穩(wěn)定，避免不必要的、過度的免疫應(yīng)答，具有明顯的抗炎和自身免疫調(diào)節(jié)作用。Th17與Treg細(xì)胞類似于Thl與Th2之間的平衡，兩者功能相互拮抗，兩者之間平衡維持或破壞對于免疫穩(wěn)定或炎癥性疾病的發(fā)病具有重要意義。

本研究中亦發(fā)現(xiàn)在COPD急性期和緩解期患者，其血漿MMP-9增高時(shí)Th17細(xì)胞表達(dá)也增高，兩者存在一定相關(guān)性。其機(jī)制可能為COPD患者由于多種炎癥介質(zhì)刺激Th17細(xì)胞高表達(dá)，其分泌IL-17增高，通過募集過多炎癥細(xì)胞如中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞到達(dá)炎癥部位，釋放更多的MMP-9、彈性蛋白酶等[11]，從而進(jìn)一步造成肺組織損傷、基質(zhì)損傷釋放彈性蛋白片段，而彈性蛋白片段作為自身抗原激活自體免疫反應(yīng)，刺激組織炎癥反應(yīng)加重，釋放更多炎癥介質(zhì)，形成“瀑布效應(yīng)”。另外在各種感染、化學(xué)性刺激物、煙草煙霧等刺激下，肺的實(shí)質(zhì)細(xì)胞如支氣管上皮細(xì)胞、Ⅱ型肺泡細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞和肺的各種炎性細(xì)胞如中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞及自然殺傷細(xì)胞與樹突狀細(xì)胞等均能產(chǎn)生MMP-9，可能MMP-9也會(huì)通過IL-6、TGF-β影響CD4+T細(xì)胞分化，使Th17表達(dá)增高，使Treg表達(dá)下降。Sylvester等[12]研究發(fā)現(xiàn)，IL-l7能通過NF-kB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘導(dǎo)牛軟骨細(xì)胞表達(dá)引起MMP-9的表達(dá)增高，在人體內(nèi)是否存在IL-17通過其通路使支氣管上皮細(xì)胞、Ⅱ型肺泡細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞和肺的各種炎性細(xì)胞如中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞及自然殺傷細(xì)胞與樹突狀細(xì)胞等釋放MMP-9增高，尚需進(jìn)一步研究。

綜上，MMP-9、MMP-9/TIMP-1、Th17細(xì)胞、Th17/Treg在COPD急性加重期組明顯增高，在COPD緩解期組MMP-9、MMP-9/TIMP-1、Th17細(xì)胞與健康組比較增高明顯，所以COPD患者可能存在自體免疫介導(dǎo)的慢性炎癥反應(yīng)，通過免疫調(diào)節(jié)劑的治療，有望阻斷自體免疫反應(yīng)，進(jìn)而緩解和控制COPD的進(jìn)展。健康吸煙組MMP-9、MMP-9/TIMP-1、Th17、Th17/Treg均較健康非吸煙組升高。所以吸煙容易促發(fā)炎癥反應(yīng)，戒煙對防治慢性阻塞性肺疾病是非常重要的。另外在COPD組，MMP-9與Th17占CD4+T比例呈正相關(guān)，其確切機(jī)制有待進(jìn)一步研究，這可能也將為慢性阻塞性肺疾病尋找到一個(gè)新的治療靶點(diǎn)。

參 考 文 獻(xiàn)

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