苗藥組方霧化劑對(duì)染矽塵肺纖維化大鼠模型血清SOD、NO水平及肺組織細(xì)胞凋亡基因FasL表達(dá)的影響*

★ 黃高 何光志* 宋貴喜 王昆 劉霞 王文佳 楊長(zhǎng)福

(1.貴陽中醫(yī)學(xué)院 貴陽 550002；2.貴州省總隊(duì)離職干部休養(yǎng)所 貴陽 550002)

矽肺(silicosis)是塵肺中最為嚴(yán)重的一種類型，通常由于長(zhǎng)期吸入含有游離二氧化硅(SiO2)的粉塵所引起。如果空氣中游離二氧化硅的含量越高，顆粒越小(1-4μm)，接觸時(shí)間越長(zhǎng)，越易發(fā)病，病情進(jìn)展愈快，病變會(huì)越發(fā)嚴(yán)重。矽肺的主要病理改變是肺組織彌漫性纖維化，臨床表現(xiàn)活動(dòng)性呼吸困難、限制性通氣障礙、彌散功能降低和低氧血癥等。本病屬中醫(yī)學(xué)的“咳嗽”、“肺痿”、“肺脹”等范疇。本病病位在肺,本虛標(biāo)實(shí)，本虛為肺虛津氣失于濡養(yǎng)，標(biāo)實(shí)則多為痰(熱)瘀毒，同時(shí)與肝、脾關(guān)系密切。

到目前為止，中醫(yī)、西醫(yī)治療矽肺患者的手段比較局限，而采用苗醫(yī)藥防治矽肺患者的報(bào)道很少。因此，本研究能夠給臨床防治矽肺提供新的思路與方法，通過對(duì)矽肺患者辯證論治，并結(jié)合貴州省名中醫(yī)朱祝生教授治療矽肺患者已取得的臨床經(jīng)驗(yàn)。苗藥霧化劑由鼠曲草、巖壁菜、巖豇豆、枇杷樹根、矮地茶、鐵掃帚、吉祥草、折耳根、白果和黃芪組成，具有清肺止咳，祛濕化痰之功效；中藥組方由半夏、茯苓、陳皮、桔梗、蘇子、葶藶子、海浮石、黃芪、黨參、丹參、當(dāng)歸、川芎、三七和甘草組成，具有化痰止咳，補(bǔ)虛化瘀之功效。通過對(duì)染矽塵大鼠肺纖維化肺動(dòng)物模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清的SOD、NO以及肺組織中FasL基因進(jìn)行檢測(cè)，探索苗藥組方霧化劑對(duì)矽肺的影響。

1 材料與主要儀器

1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)SD大鼠，體重180-220g，雄性，購自重慶市中藥研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所(許可證號(hào)：SCXK(渝)2007-0006)。

1.2 與試劑 苗藥組方霧化劑(貴陽中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院制備)；中藥購于貴陽中醫(yī)學(xué)院一附院；地塞米松磷酸鈉注射液(貴州光正制藥有限責(zé)任公司，1mL：5mg×10支，國(guó)藥準(zhǔn)字HS2020793)；二氧化硅結(jié)晶型標(biāo)準(zhǔn)品(美國(guó)Sigma公司)純度99%,粒子直徑在0.5-10μm間,其中80%在1-5μm間；DNA Marker DL2000和2×TaqPCR Master Mix(大連寶生物工程有限公司)；總RNA抽提試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(GIBCOBRL公司產(chǎn)品)；超氧化物歧化酶(SOD)WST-1法測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所，貨號(hào)：A001-3)；一氧化氮(NO)測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所，貨號(hào)：A013-2)。

1.3 主要儀器 紫外分光光度計(jì)(美國(guó)Pharmacia Biotech)；低速離心機(jī)(LD4-2)，北京醫(yī)用離心機(jī)廠；超生波霧化器(粵華WH-2000)；超低溫冰箱(Thermo Scientific Revco PLUS新型 -86℃)；德國(guó)Hettich低溫高速離心機(jī)；控溫水浴搖床(美國(guó)FORMA)；超微量全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Multisksn Go)；顯微鏡攝像CCD照相系統(tǒng)(日本DP73+standard1.6)。

2 方法

2.1 造模 按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)教程》“矽肺模型造?！狈椒╗1]，選用清潔級(jí)SD大鼠58只(造模過程中死亡7只)，隨機(jī)分為對(duì)照組(生理鹽水組)、染矽塵組(二氧化硅模型組)、治療1組(糖皮質(zhì)激素霧化組)、治療2組(苗藥組方霧化劑霧化組)及治療3組(苗藥組方霧化劑合中藥組)。各組大鼠10%水合氯醛麻醉后，氣管注入1mL各實(shí)驗(yàn)用液體，立即將大鼠頭部抬起直至大鼠完全直立，令實(shí)驗(yàn)用液體在兩肺均勻分布。對(duì)照組注入滅菌生理鹽水，模型組和治療組給予50mg/mL二氧化硅粉塵懸液。待造模成功后，在15L玻璃容器內(nèi)(霧化時(shí)預(yù)留通氣口)，治療1組給予糖皮質(zhì)激素5mg(生理鹽水配)每天霧化15min(霧化量0.5mL/min)，治療2組給予苗藥組方霧化劑每天霧化40分鐘(霧化量0.5mL/min)，治療3組給予苗藥組方霧化劑霧化每天40min(霧化量0.5mL/min)加中藥灌胃，每周7次。對(duì)照組、模型組、治療1、2組給予等體積的生理鹽水灌胃，各組動(dòng)物于造模成功后40d處死。

2.2 動(dòng)物處理及標(biāo)本采集 造模30d后，隨機(jī)取模型組大鼠肺組織HE染色。治療組治療結(jié)束后，各組大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，腹主動(dòng)脈采血離心3000r/min,15min取血清，同時(shí)取大鼠肺組織-80℃儲(chǔ)藏備用。

2.3 SOD抑制率測(cè)試 將每組每份待測(cè)血清分別取20μL放入測(cè)定孔中，另取1例對(duì)照組血清20μL。放入測(cè)定空白孔中，在對(duì)照孔和對(duì)照空白孔中分別加入雙蒸水20μL，然后在對(duì)照孔和測(cè)定孔中分別加入酶工作液20μL，在對(duì)照空白孔和測(cè)定空白孔中分別加入酶稀釋液20μL，最后在各孔中分別加入底物應(yīng)用液200μL，通過超微量全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀檢測(cè)每份血清的SOD抑制率。

2.4 NO含量測(cè)定 按照南京建成生物工程研究所提供的一氧化氮(NO)測(cè)試盒(貨號(hào)：A013-2)說明書步驟，通過超微量全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀檢測(cè)每份血清NO含量。

2.5 RNA提取與RT-PCR檢測(cè) 從-70℃超低溫冰箱取出待檢組織，采用RNA抽提試劑盒進(jìn)行抽提肺組織的總RAN，在分光光度計(jì)上測(cè)量吸光度。以總RAN為模板，以O(shè)ligo(dT)18為引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。根據(jù)根據(jù)FASL在GenBank登錄序列(MMU06948)，采用引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物：FASL-Forward：5-CTACCACCGCCATCACAACC-3；Reverse：5-GTTTAGGGGCTGGTTGTTGC-3,，擴(kuò)增序列456bp;內(nèi)參基因-Forward：5'-TGA ACG GGA AGC TCA CTG G-3'，Reverse：5'-TCCACCACCCTGTTGCTGGA-3'，其擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為307 bp。采用25μL反應(yīng)體系，PCR反應(yīng)體系為：2×TaqPCR Master Mix:12.5μL；cDNA產(chǎn)物：1.5μL；無菌水：9.5μL，上下游引物各0.75μL。采用PCR技術(shù)檢測(cè)各組肺組織細(xì)胞凋亡基因FASL表達(dá)影響。擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上電泳，用Bio-RadQuantity One軟件對(duì)電泳條帶進(jìn)行掃描和光密度分析。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有結(jié)果均以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差表示用SPSS21.0軟件進(jìn)行方差分析P﹤0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 模型癥狀觀察 照模后，發(fā)現(xiàn)各造模大鼠呼吸急促，喘息明顯，飲食下降，身體倦怠，精神萎靡，體重減輕。

3.2 模型組大鼠肺組織大體觀察HE染色 正常對(duì)照組大鼠肺組織見圖1。造模30天后，隨機(jī)取大鼠肺組織肉眼觀察發(fā)現(xiàn)模型大鼠雙肺有針尖大小散在灰白色結(jié)節(jié)，觸之有砂粒感。HE染色，光鏡下可見模型組肺泡壁破壞，結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡腔擴(kuò)大，間質(zhì)內(nèi)有大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)、巨噬細(xì)胞增多,出現(xiàn)明顯矽結(jié)節(jié)，結(jié)節(jié)由成纖維細(xì)胞、纖維細(xì)胞和膠原纖維組成，呈同心圓結(jié)構(gòu)。見下圖2。

圖1 正常組大鼠肺組織(HE×200倍)

圖2 染矽塵大鼠矽結(jié)節(jié)模型(HE×200倍)

3.3 血清SOD抑制率變化和NO含量變化 對(duì)照組血清中SOD抑制率明顯高于染矽塵組(差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P﹤0.05)。通過不同途徑治療后，治療1、2和3組血清中SOD活力明顯高于染矽塵組(差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P﹤0.05)，各治療組治療效果相當(dāng)。說明通過不同途徑給藥后，藥物對(duì)染矽塵大鼠血清SOD抑制率有增強(qiáng)作用，苗藥組方霧化劑對(duì)增加染矽塵大鼠血清SOD活力有一定效果。

染矽塵組血清中NO含量明顯高于對(duì)照組(差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P﹤0.05)。通過不同途徑治療后，染矽塵組血清中MDA含量明顯高于治療1、2和3組(差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P﹤0.05)，治療2、3組優(yōu)于治療1組。說明通過不同途徑給藥后，藥物對(duì)降低染矽塵大鼠血清NO含量的作用，苗藥組方霧化劑對(duì)減少染矽塵大鼠血清NO含量有一定效果。

表1 各組大鼠血清SOD抑制率和NO含量變化±s，n=10)

3.4 FasL基因表達(dá)檢測(cè) 經(jīng)過RT-PCR擴(kuò)增FasL基因，與對(duì)照組肺組織比較，發(fā)現(xiàn)染矽塵組、治療1組、治療2組和治療3組肺組織FasL-mRNA含量明顯高于對(duì)照組(P﹤0.05)，染矽塵組肺組織FasL-mRNA含量明顯高于其他各組(P﹤0.05)，治療1組、治療3組和治療2組各組間肺組織FasL-mRNA含量存在差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹤0.05)。結(jié)果提示通過不同途徑給藥后，中西藥物對(duì)染矽塵大鼠肺組織FasL基因表達(dá)有抑制作用，但苗藥組方霧化劑具有顯著降低染矽塵大鼠肺組織FasL基因表達(dá)作用，結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠肺組織FasLmRNA表達(dá)結(jié)果比較±s，n=10)

4 討論

在矽肺的形成過程中，動(dòng)物體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量的自由基，從而導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)氧化/抗氧化失衡，這種失衡是粉塵所致肺組織損傷的原因之一。SOD是體內(nèi)清除氧自由基的重要酶，SOD抑制率水平越低反映機(jī)體自由基的清除能力越低。NO在生物體內(nèi)是一種反應(yīng)性極強(qiáng)的自由基，兼有第二信使和神經(jīng)遞質(zhì)的作用，NO含量越高說明機(jī)體內(nèi)自由基含量增多。本次研究發(fā)現(xiàn)，染矽塵組大鼠血清中SOD抑制率水平明顯降低，NO含量明顯增加，通過苗藥組方霧化劑霧化治療后，大鼠血清中SOD抑制率明顯增加，NO含量明顯下降，苗藥組方霧化劑配合中藥灌胃作用更明顯。

FasL主要在被激活的T細(xì)胞和B細(xì)胞上表達(dá)[2]。它能誘發(fā)大鼠肺組織細(xì)胞凋亡，在多種肺疾病的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用，表達(dá)量越高說明細(xì)胞凋亡越顯著。本次研究中發(fā)現(xiàn)，染矽塵組大鼠肺組織FasL基因表達(dá)明顯高于其他各組，通過苗藥組方霧化劑霧化治療后，大鼠肺組織FasL基因表達(dá)能明顯下降，苗藥組方霧化劑配合中藥灌胃效果更好。

通過本項(xiàng)研究證明，激素對(duì)矽肺的治療是有效的，但不能夠大劑量長(zhǎng)期使用，在預(yù)示實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，按常規(guī)量霧化超過30天后霧化大鼠會(huì)食欲下降，食量減少，體重減輕，繼續(xù)下去會(huì)很快死亡，因此本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)治療1組每次霧化的激素量都有所減少，苗藥組方霧化劑在霧化過程中沒有發(fā)生此類情況，并對(duì)矽肺的治療有一定的效果，中藥灌胃能增強(qiáng)苗藥組方霧化劑的治療效果，兩者可以搭配使用。

[1]胡建華，姚明，崔淑芳.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)教程[M].上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，2009：1.

[2]袁紅.Fas/FasL與凋亡研究進(jìn)展[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)-生理病理科學(xué)與臨床分冊(cè)，2000，20(1)：26-29.