HPLC法測定清肝利膽顆粒中梔子苷含量

★ 李建明 何楊虎 支永英 嚴(yán)健良

(江西天施康中藥股份有限公司貴溪分公司 江西 鷹潭 335000)

清肝利膽顆粒是由口服液改劑型研制而成，由茵陳、厚樸、梔子、金銀花、防己組成，能清利肝膽濕熱，臨床主治納呆、脅痛、疲倦、乏力、尿黃、苔膩、脈弦、肝郁氣滯、肝膽濕熱未清等癥[1]?，F(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中采取HPLC法測定厚樸酚含量，但由于其工藝為水煎煮，厚樸酚與和厚樸酚得率非常低(低于萬分之一)，測定其含量意義不大，故本文采取測定梔子中梔子苷的含量來進行質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀Agilent1100系列 ：G1311A四元泵，G1315B DAD檢測器，全自動進樣器，Agilent化學(xué)色譜工作站；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計；Sartorius BP211D十萬分之一電子天平。色譜柱：Diamonsil C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；資生堂C18柱 (100mm ×4.6 mm,3μm)；Agela venusil MP C18柱 (250mm×4.6mm,5μm)。

1.2 試劑 乙腈為色譜純，水為三重蒸餾水，其他試劑均為分析純。

1.3 試藥 清肝利膽顆粒(江西天施康中藥股份有限公司余江分公司，批號：120206、120306、120307)；梔子苷對照品(中國藥品生物制品檢定所提供，批號為110749-200511，供含量測定用)。

2 方法與結(jié)果

2.1 檢測波長的確定 梔子苷對照品適量，分別置100mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。通過紫外可見分光光度計對對照品溶液進行200～400nm掃描，結(jié)果梔子苷在239nm波長處有最大吸收,參考文獻，最終確定為238nm[2]。

2.2 色譜條件 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)；以乙腈-水 (10∶90)為流動相，流速為1mL/min，檢測波長為238nm，柱溫為室溫。理論板數(shù)按梔子苷峰計算應(yīng)不低于3000。在此條件下對照品、供試品在25.7min左右出峰。

2.3 線性范圍 精密稱取梔子苷對照品18.16mg，置100mL容量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻,再精密量取3mL，置10mL容量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得梔子苷對照品溶液。精密吸取梔子苷對照品溶液1, 5, 10, 15 ,20, 30μL，注入液相色譜儀，按正文色譜條件測定峰面積，分別以梔子苷峰面積積分值為縱坐標(biāo)，各自對照品進樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，梔子苷回歸方程為Y=1477.552959X-1.768984，r=0.99999。梔子苷在0.05448～1.6344μg之間呈良好線性。

2.4 陰性對照試驗 按處方取不含梔子的其他藥材，制備成梔子陰性對照溶液，另取傾肝瀝膽顆粒樣品(批號：120206)0.5g，精密稱定，依法制備供試品溶液。分別取10μL進樣，結(jié)果供試品中梔子苷色譜峰有較好的色譜分離，見圖1。

A.梔子苷對照品；B.供試品；C.梔子陰性對照

2.5 精密度試驗 精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10μL，按上述色譜條件，重復(fù)進樣6次，測定梔子苷對照品溶液和供試品溶液中梔子苷峰面積，結(jié)果峰面積RSD分別為0.1%，0.3%。

2.6 重復(fù)性試驗 取本品內(nèi)容物(批號：120206)適量，按樣品測定項下方法，平行制備六份供試品溶液,按上述色譜條件，進樣測定梔子苷峰面積，結(jié)果峰面積RSD為1.2%。

2.7 穩(wěn)定性試驗 精密吸取供試品溶液,按上述色譜條件，每隔一定時間進樣一次測定供試品溶液中梔子苷峰面積,結(jié)果供試品溶液中梔子苷在24 h內(nèi)峰面積無明顯變化，其峰面積RSD分別為1.1%。

2.8 加樣回收率試驗 取本品內(nèi)容物(批號：120206)0.60g,0.25g和0.20g，分別精密稱定，置具塞錐形瓶中，各精密加入梔子苷對照品4.874mg，1.816mg和1.652mg，按樣品測定項下方法，制備成高、中、低三個濃度的供試品加樣回收率試驗樣品，按上述色譜條件進樣，計算回收率，結(jié)果高、中、低三個濃度的供試品加樣平均回收率分別為98.32%，99.77%和99.01%，RSD值分別為1.85%，1.30%和1.61%。

2.9 樣品測定 取本品約0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率250W，頻率25kHz)30min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按上述色譜條件，測定梔子苷的含量。結(jié)果見表1。

表1 3批清肝利膽顆粒含量測定結(jié)果(n=3)

3 討論

清肝利膽顆粒中厚樸有效成分厚樸酚與和厚樸酚難溶于水，采用水煎煮提取，成品中轉(zhuǎn)移率很低，而梔子中有效成分梔子苷易溶于水，提取率較高，成品含量也較高，因此采用HPLC法測定本品中梔子苷的含量，更有利于產(chǎn)品的質(zhì)量控制。

本試驗研究了供試品溶液制備方法，通過考察提取溶媒的種類(甲醇、50%甲醇、乙醇、稀乙醇)，提取方法(回流提取和超聲提取)，超聲提取溶媒用量，以及超聲提取時間(10～50min)，從而確定最佳供試品溶液的制備方法。

本試驗考察了Diamonsil C18，資生堂C18柱，Agela venusil MP C18柱三種色譜柱對本方法的檢測耐用性，結(jié)果表明梔子苷峰在各種色譜柱均分離良好，測得含量無顯著差異，說明方法重視性良好。

[1]國家食品藥品監(jiān)督管理局藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：WS3-182(Z-182)-2002(Z)(清肝瀝膽顆粒).

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典·一部[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010：1 116.