熱敏灸對PCPA致失眠大鼠SOD、MDA的影響*

★ 肖愛嬌 付勇 王河寶 康明非**

(1.江西中醫(yī)藥大學 江西 南昌 330004； 2.江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院針灸康復科 江西 南昌 330006)

失眠是睡眠障礙中最常見的一種類型，通常指患者對睡眠時間和(或)質量不滿足并影響白天社會功能的一種主觀體驗[1,2]。隨著生活節(jié)奏的加快，競爭壓力的增大，睡眠障礙已經成為一個影響現(xiàn)代人健康的重要問題，并越來越成為威脅世界各國公眾的一個突出問題。據世界衛(wèi)生組織對14個國家15個地區(qū)的25 916名在基層醫(yī)療就診的病人進行調查，發(fā)現(xiàn)27%的人有睡眠問題；美國的失眠發(fā)生率高達32%～50%，英國10%～14%，日本20%，法國30%，中國也在30%以上。目前臨床上治療失眠的西藥多是一些鎮(zhèn)靜、安眠的精神藥物，雖短期癥狀緩解明顯，但長期服用會導致藥物依賴性、嗜睡、乏力、步態(tài)不穩(wěn)等不良反應[3]，最終影響神經系統(tǒng)功能。而中醫(yī)療法治療失眠具有較好的效果。

艾灸法作為針灸療法的重要組成部分，是借助艾草燃燒時發(fā)出的藥力和紅外線溫熱刺激，來熏灼特定的穴位，刺激組織以調和氣血、疏通經絡，從整體上調節(jié)臟腑功能，以達到治病防病、養(yǎng)生保健的目的。該療法操作簡便，療效顯著，無任何副作用，正日益受到患者的親睞。臨床研究觀察到艾灸治療失眠病人具有較好的效果[4,5]。而腧穴熱敏化艾灸新療法(即熱敏灸療法)的出現(xiàn)，則大幅度提高了艾灸臨床療效，改觀了中國灸療臨床現(xiàn)狀[6]。臨床研究表明，熱敏灸治療多種疾病具有良好的療效，其治療失眠也取得了很好的療效[7]。然而熱敏灸如何治療失眠的機理還不清楚。據報道，睡眠剝奪大鼠體內存在SOD活性、MDA含量的異常[8,9]。那么，熱敏灸能否通過調節(jié)機體抗氧化能力達到改善睡眠的效果？為此，本研究采用腹腔注射對氯苯丙氨酸(PCPA)制備失眠大鼠模型，采用行為觀察法、分光光度法等研究熱敏灸對大鼠行為活動、SOD活性和MDA含量的影響，了解熱敏灸治療失眠的效果，闡明熱敏灸治療失眠的作用機理，為熱敏灸治療睡眠障礙提供理論和實驗依據，促進熱敏灸在睡眠障礙防治中的應用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物與分組 SD大鼠32只，雄性，體質量200g左右，由南昌大學醫(yī)學院動物科學部提供，適應性喂養(yǎng)1周后，采用隨機數字表將大鼠分為正常對照組(A)，模型組(B)，艾灸組(C)，熱敏灸組(D)，每組8只。正常對照組(A組)：腹腔注射生理鹽水，1次/d，共2d。模型組(B)：腹腔注射對氯苯丙氨酸(PCPA,300mg/kg)進行造模，1次/d，共2d。艾灸組(C)：同模型組，并艾灸“百會”穴，1次/d，15min/次，共5d。熱敏灸組(D)：同模型組，并艾灸“百會”穴，1次/d，40min/次，共5d。

1.1.2 主要試劑 對氯苯丙氨酸(PCPA，美國sigma公司)；超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；BCA蛋白定量試劑盒(北京百泰克生物技術有限公司)。

1.1.3 主要儀器 EthoVision XT動物行為跟蹤系統(tǒng)(荷蘭Noldus公司)；Scientz-ⅡD型超聲波細胞粉碎機(寧波新芝生物科技股份有限公司)，RT-6000酶標儀(深圳雷杜生命科學股份有限公司)；UV759S紫外——可見分光光度計(上海精密科學儀器廠)；HH-4數顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)；HH·W21·420S數顯電熱恒溫水溫箱(上海躍進醫(yī)療器械有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 失眠大鼠模型制備 采用腹腔注射PCPA制備失眠大鼠模型，根據文獻[10]報道進行操作，即對B、C、D組大鼠，將PCPA用弱堿性(pH 7～8)生理鹽水配置成混懸液，按300mg/kg體質量進行腹腔注射，1次/d，連續(xù)注射2d。

1.2.2 艾灸取穴與方法 在大鼠失眠模型造成后次日，即腹腔注射PCPA后第3日，將C、D組大鼠的頭部的毛發(fā)剪去，露出“百會”[11]，作為艾灸穴位。

艾灸方法：用直徑0.4cm，長10cm的艾條(江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院制)，距穴位2cm左右溫和灸大鼠，1次/ d， C組15min/次，D組40min/次，共5d。

1.2.3 大鼠行為學觀察 在第一次腹腔注射PCPA 28～30h后，每日定時錄制視頻30min，共5d，觀察各組大鼠活動情況。

1.2.4 大鼠空間學習記憶力測試 于艾灸治療期間，采用Morris水迷宮測試大鼠的逃避潛伏期，2次/d，共5d。測試方法：將測試時間設置為60s，操作者分別從兩個入水點將大鼠面向池壁放入水中，觀察并實時記錄大鼠在60s內找到并爬上平臺所需的時間，即逃避潛伏期。大鼠如果在60s內仍未找到平臺，則將其牽引至平臺停留10s，引導其學習記憶，潛伏期記為60s。逃避潛伏期越短，學習記憶力越好。

1.2.5 大鼠血清、腦干SOD活性和MDA含量的測定 (1)血清標本收集。治療結束后次日，大鼠用3%戊巴比妥鈉(30～40mg/kg)腹腔注射麻醉后，抽取腹主動脈血5mL置于離心管，然后以3 000r/min的速度離心15min，收集血清。

(2)腦干標本收集。待抽取腹主動脈血后，斷頭取腦，在冰上分離腦干，稱取重量后按照1∶9(g/mL)的比例加入生理鹽水，制成10%勻漿液，2 000r/min離心10min，收集上清液。

上述標本SOD活性采用WST-1法，MDA含量采用TBA(硫代巴比妥酸)法進行測定。同時采用BCA法檢測大鼠腦干蛋白質的濃度。所有步驟均嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

2 結果

2.1 大鼠的行為學觀察 適應期間，所有大鼠活動良好，警覺性好，進食飲水正常，晝夜節(jié)律正常。在第一次腹腔注射PCPA 28～30h后，B、C、D組大鼠出現(xiàn)晝夜節(jié)律消失，白天活動不停，整體觀察與A組有明顯不同，表明模型成功。而給予艾灸治療后，熱敏灸組大鼠晝夜節(jié)律有所好轉，白天能較安靜入睡，行為活動趨于正常。

2.2 熱敏灸對失眠模型大鼠逃避潛伏期的影響 從表中可以看出，第1d測試，各組大鼠平均逃避潛伏期均比較接近，自第2～5d，各組大鼠平均逃避潛伏期迅速下降。此外還可看到，在2～5d測試中，模型組大鼠的逃避潛伏期基本上均長于正常組大鼠；與模型組相比，艾灸組與熱敏灸組大鼠的逃避潛伏期基本上均短于模型組大鼠，尤其是熱敏灸組大鼠第3d明顯短于模型組大鼠(P﹤0.05)。結果見表1。

表1 熱敏灸對失眠模型大鼠逃避潛伏期的影響

注：#P﹤0.05與模型組相比。

2.3 熱敏灸對失眠模型大鼠血清SOD活性和MDA含量的影響 從表中可知，模型組大鼠血清SOD活性低于正常組(P﹤0.05)，MDA含量與正常組接近，SOD/MDA比值仍低于正常組；艾灸組SOD活性與模型組接近，MDA含量明顯低于模型組(P﹤0.05)，SOD/MDA比值高于模型組，但差別無統(tǒng)計學意義；熱敏灸組SOD活性高于模型組，MDA含量明顯低于模型組(P﹤0.05)，SOD/MDA比值明顯高于模型組，差別有統(tǒng)計學意義(P﹤0.05)。見表2。

表2 熱敏灸對失眠模型大鼠血清SOD活性和MDA含量的影響

注：※P﹤0.05與正常組相比；#P﹤0.05與模型組相比。

2.4 熱敏灸對失眠模型大鼠腦干SOD活性和MDA含量的影響 從表中可知，模型組大鼠腦干SOD活性低于正常組，MDA含量高于正常組，SOD/MDA比值低于正常組；艾灸組SOD活性與模型組接近，MDA含量明顯低于模型組(P﹤0.05)，SOD/MDA比值明顯高于模型組，差別有統(tǒng)計學意義(P﹤0.05)；熱敏灸組SOD活性明顯高于模型組(P﹤0.05)，MDA含量明顯低于模型組(P﹤0.05)，SOD/MDA比值明顯高于模型組，差別有統(tǒng)計學意義(P﹤0.05)。見表3。

表3 熱敏灸對失眠模型大鼠腦干SOD活性和MDA含量的影響

注：※P﹤0.05與正常組相比；#P﹤0.05與模型組相比。

3 討論

目前睡眠剝奪動物模型很多，包括：應激相關模型(如心理應激、物理應激、圍產期應激等)、藥理學模型(使用PCPA、腺苷、咖啡因、5-HT、多巴胺、前列腺素、神經肽類等)、疾病和病理生理異常模型(神經變性疾病、代謝紊亂、血壓異常、老化、感染等)、遺傳模型等。相對于睡眠剝奪的其他方法而言，腹腔注射對氯苯丙氨酸(PCPA)致失眠模型較為常用。有證據證明5-HT是引發(fā)非快速動眼睡眠的重要神經遞質，通過注射色氨酸羥化酶的抑制劑PCPA來達到造模目的，而且該方法操作簡單易行，成功率高、可重復性強、具有可逆性，所致模型符合人類失眠的某些特點，現(xiàn)已成為較常用的失眠動物模型[12]。因此，本研究采用腹腔注射PCPA制備失眠大鼠模型。實驗結果觀察到，在第一次腹腔注射PCPA 28～30h后，模型組、艾灸組和熱敏灸組大鼠，出現(xiàn)晝伏夜出節(jié)律消失，白天活動不停，總睡眠時間減少，整體觀察與正常組明顯不同，表明模型制備成功。

目前，臨床研究已證明，熱敏灸治療失眠已取得了較好的療效[7]。熱敏灸，通俗地說就是在熱敏化腧穴上進行艾灸。臨床實踐發(fā)現(xiàn)，人體腧穴存在敏化態(tài)與靜息態(tài)兩種功能態(tài)，當人體發(fā)生疾病時能使體表腧穴發(fā)生敏化，敏化的類型多種多樣，而腧穴熱敏化是經穴敏化的一種新類型，處在熱敏態(tài)的腧穴對熱刺激特別敏感，能耐受較長時間(多數30min以上)的熱刺激并感到很舒適，且觀察到這種反應隨疾病的發(fā)生而產生，隨病情的改善而減輕或消失[13]。而傳統(tǒng)懸灸的灸量每次每穴一般從10min到15min，或者以局部皮膚潮紅為度，往往達不到治療個體化的最佳灸量。灸量即艾灸的每次有效作用劑量。艾灸劑量由艾灸強度、艾灸面積、艾灸時間三個因素組成，在前兩個因素基本不變的情況下，艾灸劑量主要由艾灸時間所決定。本研究同時觀察了艾灸15min(傳統(tǒng)懸灸)和艾灸40min(熱敏灸)對失眠的治療效果，結果顯示：給予艾灸治療后，與模型組相比，艾灸組和熱敏灸組，尤以熱敏灸組大鼠晝夜節(jié)律有所好轉；逃避潛伏期明顯縮短。周紅勤等[4]指出，對失眠療效的判定，除依據睡眠的時間外，更重要的是患者在治療后大腦功能的改善。治療后，患者頭腦清醒、反應迅速、思維敏捷，記憶、認知功能得到改善，即使是睡眠時間未延長，這種治療也是有效的。因此，本研究結果提示，熱敏灸具有緩解失眠癥狀、提高學習記憶力的作用，且療效優(yōu)于傳統(tǒng)懸灸。然而，熱敏灸治療失眠的作用機理還不十分清楚。

據報道，失眠大鼠體內存在SOD活性、MDA含量的異常[8,9]。那么，熱敏灸能否通過調整體內SOD活性和MDA含量而達到改善睡眠的效果？眾所周知，SOD屬于抗氧化酶，其作用主要是清除氧自由基。其實，氧自由基可以是細胞正常代謝的產物，也可由外源性因素產生。正常情況下，由于細胞內同時存在生成氧自由基的體系和拮抗其生成的抗氧化劑體系(包括抗氧化劑如維生素C、維生素E等和抗氧化酶如SOD等)，所以小量生成的氧自由基，會被SOD等細胞內外抗氧化劑清除。病理情況下(如失眠等)，氧自由基大量產生，消耗SOD等抗氧化酶，使抗氧化酶活性下降，清除自由基的能力降低，導致氧自由基積聚過多，繼而攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質過氧化反應，形成脂質過氧化物，如MDA、酮基等，損傷生物膜，進而使細胞死亡[14]。徐孝平等[9]觀察到睡眠剝奪大鼠血清SOD活性降低、MDA含量增加，大鼠體重、飲食量、飲水量均降低，出現(xiàn)各種失眠癥狀；給予中藥治療后，血清SOD活性增加、MDA含量下降，各種失眠癥狀也隨之改善。眾所周知，腦干網狀結構內存在具有上行喚醒作用的功能系統(tǒng)，也是中樞神經系統(tǒng)5-HT能神經元胞體所在的部位，該部位對睡眠及覺醒具有重要的影響。本研究同時觀察了腦干和血清SOD活性和MDA含量，研究結果提示熱敏灸可能通過提高體內SOD活性和(或)降低MDA含量而達到改善睡眠的效果。

綜上所述，我們推測熱敏灸可能通過艾灸穴位，調動機體內源性的抗病機制，通過調節(jié)機體的SOD活性和MDA含量，進而達到改善睡眠的作用。這也可能是熱敏灸治療失眠的作用機理之一。然而熱敏灸能否通過調節(jié)腦干5-HT含量發(fā)揮其治療作用還有待于將來進一步的研究。

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