高效液相法測定蝦青素的含量*

★ 饒毅 曾戀情 魏惠珍 龔建平 金浩鑫 郭強 彭琳

(1.中藥固體制劑國家工程研究中心 江西 南昌 330006；2.江西中醫(yī)藥大學 江西 南昌 330006)

蝦青素(Astaxanthin,3，3'-二羥基4,4'-二酮基-β，β'-胡蘿卜素)是一種類胡蘿卜素衍生物，呈鮮紅色，具有很強的抑制腫瘤發(fā)生和生長，抗氧化，抵御紫外線，增強人體免疫功能，改善視力、色素形成和神經連通以及改善生育等作用，特別是抗氧化作用超強，被譽為“超級抗氧化劑”[1-3]，因此在化妝品、保健品和醫(yī)藥中具有廣泛的應用前景。目前，蝦青素的檢測方法有薄層色譜法、分光光度法[4]、高效液相色譜法[5-7]。傳統(tǒng)的分光光度法只能測定總蝦青素類酯的含量。采用皂化的方法可將不同的蝦青素類酯完全皂化成游離蝦青素，并采用高效液相色譜法可以解決這個問題。本文采用高效液相色譜法，建立了皂化后游離蝦青素含量測定的方法，考察了不同皂化時間、皂化溶劑和皂化時堿濃度對游離蝦青素的影響，并測定了不同蝦青素提取物中游離蝦青素的含量。

1 儀器與材料

Waters高效液相色譜儀(Waters 2695分離單元，Waters 2996二極管陣列檢測器，Empower色譜工作站)；Millipore-Q純水器(美國Millipore公司)；HH-4型數顯恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司)；超聲波清洗儀：KQ3200(昆山市超聲儀器有限公司)。蝦青素對照品(Dr. Ehrenstorfer Gmbh，批號：CA10307000純度：97.1%)、粉狀蝦青素提取物1(Cyanotech公司)、粉狀蝦青素提取物2(飼料級)、油狀蝦青素提取物(Cyanotech公司)、普麗普萊紅球藻提取物(蝦青素)軟膠囊(PURITAN'S PRIDE,INC.Holbrook,NY 11741 U.S.A.)、金奧力蝦青素壓片糖果(威海紫光生物科技開發(fā)有限公司)，甲醇為色譜純，氯仿、無水乙醇、二氯甲烷、氫氧化鉀為分析純，水為超純水，BHT。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：色譜柱為Diamonsil C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流動相：甲醇-水(95∶5)；流速：1mL/min；檢測波長：475nm；檢測器：紫外檢測器；進樣量：10μL；柱溫：室溫。

2.2 測定方法

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取蝦青素對照品4.01mg，置50mL量瓶中，用少量二氯甲烷(1mL)振搖使溶解，用甲醇稀釋至刻度，作為對照品儲備液。精密移取此儲備液2mL置10mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 稱取8mg樣品，精密稱定，加5mL溶劑(二氯甲烷：甲醇=1∶3)，再加入3mL體積的1%KOH甲醇溶液，超聲15min，用溶劑定容至10mL。置黑暗環(huán)境下，4℃冰箱中皂化7 h左右，皂化后的蝦青素提取液過0.45μm膜作為供試品溶液。

分別取上述供試品溶液和對照品溶液各10μL注入液相色譜儀，測定峰面積。按外標法以峰面積計算蝦青素的含量，色譜圖見圖1、圖2。

圖1 蝦青素對照品溶液

圖2 粉狀蝦青素提取物1(Cyanotech公司)

2.3 線性關系考察 精密吸取2.2.1項下對照品溶液，進樣5，10，15，20，25，30μL，以峰面積(Y)對對照品量(X)進行線性回歸處理，線性方程為：Y=53774X-7242.3，r=0.9993，結果表明在0.0802～0.4812/μg內進樣體積與峰面積呈良好的線性關系。

2.4 精密度 精密吸取2.2.1項下對照品溶液10μL，連續(xù)進樣6次，測定蝦青素的峰面積，峰面積的RSD分別為0.93%，表明儀器精密度良好。

2.5 重復性試驗 取蝦青素提取液，照2.2.2項下的方法制備供試品5份，照2.1項下色譜條件測定峰面積，計算含量，結果平均含量為107.6μg/mL，RSD為1.09%。

2.6 回收率試驗 取蝦青素供試品溶液5份，分別加入2.2.1項下對照品溶液4mL，按2.1項下色譜條件進行檢測，記錄峰面積，并計算回收率，結果見表1。

表1 回收率測定結果(n=5)

2.7 不同蝦青素提取物的含量測定 實驗比較了本文建立的方法和紫外分光光度法[8]兩者的分析結果，結果如表2。結果表明，紫外分光光度法并不能準確的檢測物質中游離蝦青素的質量濃度，游離蝦青素的最大吸收波長在476nm附近，蝦青素酯在476nm波長處也存在吸收，其所測是游離蝦青素與蝦青素類酯的總和[7]。而本文建立的方法，皂化后蝦青素類酯能很好的轉化為游離蝦青素，能通過高效液相法較為準確的測出其游離蝦青素的含量。

表2 不同蝦青素產品中蝦青素測定結果

3 討論

3.1 檢測波長的選擇 經波長掃描，蝦青素在本流動相中的最大吸收波長為475nm，故選擇475為檢測波長。

3.2 皂化條件考察

3.2.1 皂化溶劑的影響 考察了甲醇、二氯甲烷、丙酮、二氯甲烷-甲醇(1∶3)、丙酮-甲醇(3∶1)作為皂化溶劑對蝦青素類酯皂化效率的影響。結果表明，使用不同皂化溶劑皂化后蝦青素的含量分別為：甲醇為0.56%，二氯甲烷為0.71%，丙酮為0.48%，二氯甲烷-甲醇為1.32%，丙酮-甲醇為0.89%。因此確定皂化溶劑為二氯甲烷-甲醇(1∶3)。

3.2.2 堿濃度的影響 不同濃度的KOH甲醇溶液影響蝦青素的皂化效率。當濃度低時皂化不完全，濃度過高又會導致蝦青素氧化，并破壞蝦青素而使得皂化效率降低。本文考察了0.1%、0.5%、1%、2%和3%不同濃度的KOH甲醇溶液的皂化效率。結果表明，當KOH甲醇溶液的濃度為1%時，能取得較好的皂化效率。其蝦青素的含量分別為：0.1%KOH甲醇為0.44%，0.5%KOH甲醇為1.26%，1%KOH甲醇為1.36%，2%KOH甲醇為0.46%，3%KOH甲醇為0.076%。因此確定KOH甲醇的濃度為1%。

3.2.3 皂化時間的影響 在確定了上述皂化條件后，對不同的皂化時間進行考察，分別考察了皂化1，3，5，7，9，11，13h和15h，結果表明，皂化時間為7h時，蝦青素的含量最大。其蝦青素的含量分別為：1h為0.52%，3h為0.91%，5h為1.10%，7h為1.36%，9h為1.35%，11h為1.32%，13h為1.11%，15h為1.05%。因此確定皂化時間為7h。

4 結論

本文建立了KOH皂化不同蝦青素提取物中蝦青素類脂，高效液相色譜紫外檢測游離蝦青素含量的方法，該方法操作簡便、快速、準確、穩(wěn)定可靠，可用于蝦青素的含量測定；優(yōu)化了皂化條件，使得皂化更加方便、簡單、快捷；分析比較了紫外分光光度法和高效液相法測定不同蝦青素提取物中蝦青素的含量，結果表明，紫外分光光度法不能準確測定游離蝦青素的含量。

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[8]GB/T 23745-2009,飼料添加劑-10%蝦青素[S].