黃芪藥材有效成分含量的相關性研究

★ 菅曉勇 鄧雙炳

(1.北京康樂衛(wèi)士生物技術股份有限公司 北京 100176；2.北京博愛匯康醫(yī)藥科技有限責任公司 北京 100176)

黃芪藥材[Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bunge]為常用補中益氣類中藥，在抗腫瘤、抗疲勞、增強免疫等方面具有廣泛的藥理活性，而這些諸多藥理活性的體現(xiàn)源于中草藥內(nèi)在的多種活性成分綜合相互作用的結果。黃芪素以“炮臺芪”的質優(yōu)、純正享譽海內(nèi)外，且與藥材具體的基源、產(chǎn)地和生長年限有著千絲萬縷的密切聯(lián)系，其中尤以體現(xiàn)在主要的有效化學成分皂苷類、黃酮類以及多糖類的含量方面[1-4]。然而《中國藥典》(2010版)中僅規(guī)定黃芪甲苷和毛蕊異黃酮苷含量作為黃芪質量的主要評價指標，顯然不能全面地反映藥材的內(nèi)在質量，需要探索更為科學的評價指標和體系，近幾年的研究前景顯示多指標綜合評價體系用于黃芪質量評價可能具有更好的應用前景[4-6]。

為此，本文對黃芪藥材含有的5種主要有效(活性)化學成分的總量和基于《中國藥典》(2010版)的3種相關單一成分分別進行含量測定并歸納分析，對分析測定結果進行多指標、多元分析，研究黃芪藥材內(nèi)在有效成分含量之間的相關性，以期為黃芪質量評價和內(nèi)在質量控制方法的科學性、合理性以及簡便化，尤以探索黃芪藥材質控方法的“一測多評”提供可能的研究基礎。

1 實驗材料

1.1 藥材 本文研究所用的黃芪樣品均為原產(chǎn)地實地采集或購于當?shù)?No.1-No.10)，全部樣品均經(jīng)中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所郭寶林老師鑒定基源為蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch) Bge var.mongholicus(Bge)Hsiao(除No.1)。上述藥材待自然干燥后截成小段，60°C烘箱中干燥6～8h，粉碎過篩后，作為含量測定用樣品，見表1。

1.2 對照品及試劑 葡聚糖、蘆丁、毛蕊異黃酮、芒柄花素、黃芪甲苷對照品均購買于中國食品藥品檢定研究院(含量測定用)；化學試劑：乙腈和甲醇均為色譜純級，其他試劑為分析純級。

1.3 儀器 安捷倫1260型液相色譜儀(美國安捷倫科技公司)；Chromachem-6100型ELSD檢測器(美國ESA公司)；UV5100型紫外可見分光光度計(上海元析儀器有限公司)；BSA224S-CW型電子分析天平(德國賽多利斯公司)，HH-4型數(shù)字化顯示恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司)；320-S型酸度計(瑞士梅特勒-托利多公司)。

表1 不同產(chǎn)地來源、生長年限的10批黃芪藥材樣品

注：上述10批次黃芪藥材樣品均為當?shù)仉S機上山采集或當?shù)夭杉箅S機購買。

圖1 黃芪藥材黃芪甲苷HPLC圖譜(c峰為黃芪甲苷峰)

2 測定方法與含量結果

2.1 黃芪甲苷的含量測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱為Hypersil ODS2(4.6mm×250mm，5μm)；ELSD參數(shù)：霧化溫度：35°C，蒸發(fā)溫度：50°C，氮氣壓力：1.5 bar；流動相為乙腈∶水(32∶68)，流速1.0 mL/min，進樣量20μL；分離度、理論板數(shù)等應符合藥典要求。

2.1.2 配制對照品溶液 黃芪甲苷對照品精密稱定5mg，加甲醇溶解并定容至10mL容量瓶中，配制成0.5 mg/L的溶液，4°C冰箱保存，備用。

2.1.3 測定方法 參照《中國藥典》(2010年版Ⅰ部)黃芪項下規(guī)定的樣品處理及測定方法進行黃芪甲苷含量的測定(見圖1)，以外標兩點法計算黃芪甲苷的含量，結果見表2。

2.2 黃芪多糖的含量測定

2.2.1 制備蒽酮-濃硫酸溶液(0.2%)及葡聚糖對照品溶液 精密稱定蒽酮適量，緩慢加入至已置于避光棕色瓶中的濃硫酸溶液中，配制成0.2%的蒽酮-濃硫酸溶液，4°C冰箱保存，備用。

購買的葡聚糖對照品首先經(jīng)105°C干燥至恒重，精密稱定3mg，置于10mL容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，即得每1 mL含0.3mg的對照品溶液。

2.2.2 樣品測定[3,7]精密稱取黃芪細粉樣品5.0g，加水100mL置250mL燒瓶中，沸水浴提取3次，第一次提取時間為1h、第二次和第三次各提取0.5h，三次合并后的濾液濃縮至約10mL，配成含80%乙醇的混合溶液，4°C冰箱中靜置24 h，70%乙醇三次洗滌濾渣，60°C干燥，即得粗多糖并精密稱重。

取適量的黃芪粗多糖樣品，加溫水溶解制備成0.13 mg/mL粗多糖供試品溶液，量取0.4 mL，加水稀釋5倍后緩慢加入4.0 mL的蒽酮-濃硫酸溶液(0.2%)，不斷震蕩中進行10min沸水浴，反應液用冰水冷卻至室溫，穩(wěn)定顯色0.5h后采用紫外分光光度計于625 nm處(葡聚糖最大吸收波長)測定吸收度，以葡聚糖對照品溶液外標兩點法進行計算，測定黃芪多糖含量，結果見表2。

2.3 黃芪總皂苷的含量測定

2.3.1 配制黃芪甲苷對照品溶液 黃芪甲苷對照品精密稱定4mg，加甲醇溶解并定容至10mL容量瓶中，配制成0.4 mg/L的溶液，4°C冰箱保存，備用。

2.3.2 樣品測定[3,8]精密稱取40目過篩后的黃芪粉末2.0g，加100mL甲醇在250mL圓底燒瓶中冷浸過夜，第二天冷浸液甲醇回流提取2 h，甲醇25mL洗滌濾渣3次，濃縮濾液，50mL水飽和的正丁醇殘渣將殘渣溶解轉移至100mL分液漏斗中，加氨試劑各洗滌3次，第一次洗滌液為30mL、第二次和第三次各為20mL，20mL水飽和的正丁醇洗滌合并后的氨試劑層，正丁醇層收集液60°C水浴蒸干，殘渣用100mL甲醇溶解作為供試品溶液。

精密量取供試品溶液0.4mL，加入0.2mL香草醛-冰醋酸溶液(5%)和0.8mL高氯酸溶液，混合均勻，置70°C水浴中15min，冷卻。精密加入5mL冰醋酸，搖勻后在581nm處(黃芪甲苷最大吸收波長)測定吸光度，以黃芪甲苷對照品溶液外標兩點法進行計算，測得黃芪總皂苷含量(見表2)。

2.4 黃芪總黃酮的含量測定

2.4.1 對照品溶液的配制 精密稱蘆丁對照品5mg，置于10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，即得每1 mL含0.5mg的蘆丁對照品溶液，備用。

2.4.2 樣品測定[9,10]精密稱取黃芪樣品2.0g(過篩40目、60°C干燥5 h)，置100mL容量瓶中，加甲醇35mL，超聲分別提取三次(時間分為30，30，5min)，濾液加甲醇定容至50mL容量瓶中，作為供試品溶液。

精密量取2.0mL供試品溶液，加水1.0mL，置小反應瓶中，加入5% NaNO20.4 mL混合均勻，6min后加入0.4mL 10% Al(NO3)3搖勻，6min后再加4% NaOH 4 mL，后用蒸餾水定容至10mL容量瓶中，搖勻，采用紫外分光光度計于500 nm處(蘆丁最大吸收波長)測定吸收度，以蘆丁對照品溶液的外標兩點法進行計算上述黃芪樣品中有效成分總黃酮的含量(結果見表2)。

2.5 黃芪樣品中水分、干物質(DM)及粗脂肪(TP)含量測定 參照《中國藥典》2010版具體項下要求進行黃芪樣品的水分和干物質(DM)含量測定。備注：黃芪樣品扣除水分后的藥材干重占樣品全部重量的比重定義為黃芪干物質含量。結果詳見表2。

黃芪粗脂肪的測定方法如下：精密稱定黃芪粉末4.0g，置烘箱中105°C干燥。取樣品適量，精密稱定后用錫箔濾紙包裹，采用70mL石油醚(60°C～90°C)在抽提瓶中提取4 h，提取液減壓回收石油醚，殘渣干燥至恒重，稱重計算黃芪樣品中所含有效成分粗脂肪的含量，具體結果見表2。

2.6 黃芪中毛蕊異黃酮和芒柄花素含量測定

2.6.1 色譜條件 色譜柱為Hypersil ODS2 (4.6mm×200mm，5μm)；梯度洗脫條件-流動相：乙腈(A)：水(0～25min,17%～31%(A)；26min，35%(A)；26～45min，35%(A)；45～60min，35%～17%(A)；進樣量20μL，流速1.0mL/min。

2.6.2 芒柄花素和毛蕊異黃酮對照品溶液的制備 分別稱取芒柄花素及毛蕊異黃酮對照品適量，精密成定后加甲醇制備成相應溶度的對照品溶液，4°C冰箱保存，備用。

2.6.3 樣品測定[10-12]精密稱取黃芪樣品0.5g(過篩40目、60°C干燥5 h)，置100mL圓底燒瓶中，加80%甲醇30mL，3次回流提取，每次提取時間均為1h，濾液合并后回收甲醇試劑，所得殘渣甲醇溶解、定容，作為供試品溶液。按2.6.1項下色譜條件進樣測定芒柄花素和毛蕊異黃酮成分的含量(詳見色譜圖2)，結果見表2。

表2 黃芪藥材(10批)中有效成分的含量測定結果

注：IS1(X1)：毛蕊異黃酮；IS2(X2)：芒柄花素；TIS(X3)：總黃酮；AS1(X4)：黃芪甲苷；TAS(X5)：總皂苷；CF(X6)：粗脂肪；TP(X7)：總多糖；DM(X8)：干物質。

1.毛蕊異黃酮；2.為芒柄花素

3 結果與分析

3.1 黃芪藥材有效化學成分含量結果分析

由表2可知，10批黃芪藥材中有效(活性)成分芒柄花素、粗脂肪、黃芪甲苷、毛蕊異黃酮以及總多糖含量存在較大的差異。黃芪藥材NO.1～NO.10中芒柄花素含量為33.98～238(77.9±62.9)μg/g，粗脂肪含量為9.9～5.1(15.1±4.9)mg/g，黃芪甲苷含量為539～2156(1500±650)μg/g，毛蕊異黃酮含量為109.2～791.6(437.5±243.5)μg/g，總多糖含量為0.78～10.28(5.67±3.14)%等。由上述10批次黃芪樣品8種有效成分的含量測定結果分析，我們發(fā)現(xiàn)上述所有樣品中山西渾源下韓鄉(xiāng)野生黃芪藥材整體上含有較高芒柄花素、粗脂肪、黃芪甲苷、總多糖以及干物質等有效成分；陜西野生黃芪樣品的總黃酮含量則相對較高，廣靈栽培黃芪樣品整體總皂苷和毛蕊異黃酮兩種成分含量較高，而渾源縣下韓鄉(xiāng)栽培黃芪具有含量較高的總多糖成分，相反整體而言四川以及黑龍江(膜莢)兩地黃芪藥材中的上述8種成分均具有較低的含量。

綜上所述，山西為黃芪的道地產(chǎn)區(qū)，適宜的海拔、水文氣候和土壤中豐富的礦物元素使渾源縣下韓鄉(xiāng)黃芪樣品(野生和人工栽培)整體上具有較高含量的有效成分；四川和黑龍江地區(qū)可能不太適宜黃芪中有效成分的積累，以致各有效成分含量整體水平較低。

3.2 10批次不同產(chǎn)地黃芪藥材的質量評估與內(nèi)在8種有效成分之間相關性分析

3.2.1 黃芪藥材中有效成分之間PCA相關性分析 采用主成分分析(PCA)方法對上述10個批次黃芪(不同產(chǎn)地來源和年限)，可能影響黃芪藥材內(nèi)在質量的總成分和單一成分共8種主要有效成分進行主成分分析，以各成分的特征值和貢獻率(方差百分比)及累計貢獻率進行綜合評估。結果表明，第一主成分的特征貢獻率為39.7%，主要有效成分為黃芪甲苷(X4)、總多糖(X7)、粗脂肪(X6)、干物質(X8)；第二主成分的總黃酮(X3)、總皂苷(X5)、毛蕊異黃酮(X1)為主要有效化學成分，整體特征貢獻率為28.1%；第三主成分的主要有效成分為總多糖(X7)，整體特征貢獻率為12.6%。

3.2.1.2 10個批次不同產(chǎn)地和年限黃芪樣品的聚類分析

圖3 10批黃芪藥材聚類Score圖

鑒于第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2)的累積貢獻率為67.8%(3.2.1項下計算)，采用PCA分析軟件(SIMCA-P 11.5版本)在第一主成分和第二主成分綜合效益分析基礎上對上述不同產(chǎn)地來源和年限的10批次黃芪樣品進行生物生態(tài)學的聚類分析，結果詳見圖3。結果顯示，10批黃芪樣品(No.1～No.10)共聚類分為三個分布組別，即聚類組別A～C(group A，B，C)。group A主要由山西渾源縣下韓鄉(xiāng)地區(qū)的6個野生與栽培黃芪樣品組成，group B則有2個山西廣靈栽培黃芪和陜西野生組成；相反，兩個地域邊緣化的四川理縣黃芪和黑龍江(膜莢)樣品組成group C。

3.2.2 黃芪藥材中有效(活性)成分之間的關聯(lián)性分析 本文采用SPSS11.5軟件來分析黃芪有效化學成分含量之間的相互關聯(lián)性，具體分析結果如下：①黃芪藥材中有效化學成分毛蕊異黃酮含量(X1)與另一種有效成分總黃酮含量(X3)具有非常顯著的正向相關性，擬合的相關方程和相關系數(shù)為X1=-1034+720.5X3(r=0.816，P=0.003)；②黃芪藥材中有效化學成分芒柄花素含量(X2)與另一種有效成分粗脂肪含量(X6)同樣具有顯著正向相關性，擬合的相關方程及相關系數(shù)為X2=192.8-1.68(X6)2+0.0678(X6)3(r=0.961,P=0.0475)；③黃芪藥材中法定的有效成分黃芪甲苷含量(X4)則與另一種有效化學成分總多糖含量(X7)具有非常顯著正向相關性，擬合的相關方程及相關系數(shù)為X4=473+181X7(r=0.878，P=0.001)。

綜上所述，我們可以采用黃芪藥材內(nèi)在的有效成分黃芪甲苷、毛蕊異黃酮以及芒柄花素的含量多少，一定程度上可以間接、客觀地分別反映出黃芪樣品中總多糖、總黃酮和粗脂肪的含量高低，不僅可以簡化了黃芪樣品質量測定的項目，同時有望發(fā)展成為一種新的思路用于黃芪藥材質控，當然該思路和方法還需要更為廣泛的樣品量和實踐中加以系數(shù)修訂和完善。

4 結論與討論

4.1 黃芪藥材有效(活性)成分的主成分分析 本文對可能影響10批不同產(chǎn)地來源和生長年限的黃芪藥材內(nèi)在質量的8個主要有效成分指標進行了PCA主成分聚類和貢獻分析。試驗結果顯示，黃芪樣品中4種有效化學成分黃芪甲苷、總多糖、粗脂肪、干物質具有較大的貢獻，為可能影響黃芪內(nèi)在質量評估的主要指標，其次指標為總皂苷、毛蕊異黃酮、總黃酮，次之則為芒柄花素成分指標。

4.2 黃芪藥材樣品間及各指標成分聚類分析 綜合圖3以及主成分PC1特征貢獻率為39.7%，是分析的主要方面，結合聚類分析結果，可以明顯地用于區(qū)分山西渾源樣品和其他產(chǎn)地黃芪樣品，結合上述8種有效化學成分含量測定結果，本文大致可以得出以下結論：道地產(chǎn)區(qū)山西渾源縣下韓鄉(xiāng)野生黃芪內(nèi)在整體有效化學成分含量最高，質量最好；道地產(chǎn)區(qū)山西渾源縣下韓鄉(xiāng)人工栽培黃芪樣品的整體有效成分含量次之，質量相對較好；距離道地產(chǎn)區(qū)區(qū)域較近的山西廣靈人工栽培黃芪樣品與陜西野生黃芪樣品的有效成分整體也較道地產(chǎn)區(qū)渾源縣樣品低，質量相比較渾源樣品差；相反，區(qū)域相對邊緣化且不為道地產(chǎn)區(qū)的四川理縣地區(qū)和黑龍江(膜莢)黃芪的有效成分整體含量最低，質量也最差。

4.3 黃芪樣品質量評價的成分相關性探索 在對上述不同產(chǎn)地來源和年限的10批黃芪樣品中8個主要有效成分之間含量相互關聯(lián)性分析結果表明，黃芪甲苷與總多糖、毛蕊異黃酮與總黃酮、芒柄花素與粗脂肪成分之間分別存在顯著的正向相關性。綜上所述，本文通過上述研究結果，一定程度上可以支持在黃芪多指標評價和質量研究時可以簡化某些具體的檢測項目，可以嘗試采用一種有效成分的含量高低間接、客觀地反映出另一種有效成分的含量多少，試圖探索出黃芪質控的新思路(“一測多評”)，進而全面反映出黃芪藥材內(nèi)在質量的同時最大程度的節(jié)約資源。但該項研究還任重而道遠，需要業(yè)內(nèi)同仁們的共同努力，以便最終完善和相互修訂。

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