HPLC法測(cè)定穿黃清熱膠囊中穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量

★ 張若良 鐘國(guó)慶 劉小玉

(贛州市食品藥品檢驗(yàn)所 江西 贛州 341000)

穿黃清熱膠囊由穿心蓮、一枝黃花兩味藥組成,具有清熱解毒的功效，用于急性上呼吸道感染、急性扁桃體炎、咽喉炎等熱毒壅盛者。原標(biāo)準(zhǔn)只測(cè)定制劑中穿心蓮藥材的單一成分脫水穿心蓮內(nèi)酯，因穿心蓮制劑在生產(chǎn)和貯存過(guò)程中，其有效成分穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯會(huì)相互轉(zhuǎn)化，故原標(biāo)準(zhǔn)不利于產(chǎn)品的質(zhì)量控制，本文采用HPLC法對(duì)制劑中穿心蓮的有效成分穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯進(jìn)行含量測(cè)定，所建立的方法準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)，可用于該制劑的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

Waters e2695高效液相色譜儀(二極管陣列檢測(cè)器)；XS205DU型電子天平；穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品(批號(hào)110797-200307)、脫水穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品(批號(hào)110854-200306)均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；穿黃清熱膠囊(江西保利制藥有限公司，批號(hào)081201，081202，081203，規(guī)格均為0.35g)；甲醇為色譜純，水為重蒸餾水，其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:Thermo syncronis C18(4.6mm×250mm，5μm)；流動(dòng)相:甲醇-水(65∶35)；流量1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng):穿心蓮內(nèi)酯225nm，脫水穿心蓮內(nèi)酯254nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量10μL。理論板數(shù)按穿心蓮內(nèi)酯峰計(jì)算應(yīng)不低于5000，穿心蓮內(nèi)酯峰與脫水穿心蓮內(nèi)酯峰的分離度大于2.0。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品10.01mg與脫水穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品10.28mg，同置100mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液制備 取供試品20粒，精密稱定，取內(nèi)容物混勻，精密稱取約1g，置具塞錐形瓶中，精密加入40%甲醇25mL，稱定重量，浸泡1 h，超聲處理30min，取出，放冷，再稱定重量，用40%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液10mL，至中性氧化鋁柱(200～300目，5g，內(nèi)徑1.5cm)上，用甲醇15mL洗脫，收集洗脫液，置25mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 陰性溶液制備 取不含穿心蓮的陰性制劑按供試品溶液的制備方法制成陰性對(duì)照溶液。

2.3 干擾試驗(yàn) 取供試品溶液，對(duì)照品溶液和陰性溶液各10μL，注入液相色譜儀，供試品溶液主峰的保留時(shí)間與對(duì)照品主峰的保留時(shí)間一致，且陰性無(wú)干擾，見(jiàn)圖1。

A.對(duì)照品(225nm)；B.供試品(225nm)；C.陰性樣品(225nm)；D.對(duì)照品(254nm)；E.供試品(254nm)；F.陰性樣品(254nm)

圖1 HPLC色譜圖

(1.穿心蓮內(nèi)酯；2.脫水穿心蓮內(nèi)酯)

2.4 線性關(guān)系考察 精密稱取穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品12.53mg與脫水穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品12.58mg，同置50mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取0.4，1，2，5，10mL分別置10mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，各進(jìn)樣10μL測(cè)定。分別以穿心蓮內(nèi)酯及脫水穿心蓮內(nèi)酯進(jìn)樣中的量(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程，結(jié)果穿心蓮內(nèi)酯回歸方程為Y=2.0933×106X+4.4575×103，r=0.9999，脫水穿心蓮內(nèi)酯回歸方程為Y=1.5797×106X+1.1981×104，r=0.9999，結(jié)果表明，穿心蓮內(nèi)酯在0.10024～2.5060μg及脫水穿心蓮內(nèi)酯在0.10064～2.5160μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液重復(fù)進(jìn)樣5次,測(cè)得峰面積，穿心蓮內(nèi)酯的RSD為0.30%，脫水穿心蓮內(nèi)酯的RSD為0.37%。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液(批號(hào)：081201)于配制后0，2，4，6，8，10 h分別進(jìn)樣10μL，測(cè)得峰面積的RSD，穿心蓮內(nèi)酯為0.26%，脫水穿心蓮內(nèi)酯為0.67%，表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取供試品6份(批號(hào)：081201)，照供試品溶液制備方法制成供試品溶液，分別測(cè)定含量，穿心蓮內(nèi)酯平均含量為3.50mg/g，RSD為0.39%；脫水穿心蓮內(nèi)酯平均含量為7.06mg/g，RSD為0.45%。

2.8 回收率試驗(yàn) 取已知含量的供試品(批號(hào)081201)約0.4，0.5，0.6g(各3份)，精密稱定，取樣0.4g的分別精密加入對(duì)照品的40%甲醇溶液(穿心蓮內(nèi)酯0.5012mg/mL，脫水穿心蓮內(nèi)酯0.5032mg/mL)5mL，甲醇20mL，取樣0.5g的分別精密加入對(duì)照品溶液上述對(duì)照品溶液6.25mL，甲醇18.75mL，取樣0.6g的分別精密加入上述對(duì)照品溶液7.5mL，甲醇17.5mL，分別混勻后按供試品溶液制備方法處理，測(cè)定含量，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1～2。

表1 穿心蓮內(nèi)酯回收率測(cè)定結(jié)果

表2 脫水穿心蓮內(nèi)酯回收率測(cè)定結(jié)果

2.9 樣品測(cè)定 取3批樣品，依法制備供試品溶液，分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液各10μL進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果 /mg·粒-1

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 提取對(duì)照品溶液穿心蓮內(nèi)酯與脫水穿心蓮內(nèi)酯保留時(shí)間處在200～400nm的波長(zhǎng)范圍內(nèi)的光譜圖，結(jié)果穿心蓮內(nèi)酯在225nm，脫水穿心蓮內(nèi)酯在254nm，有最大吸收，參照文獻(xiàn)，選用穿心蓮內(nèi)酯225nm，脫水穿心蓮內(nèi)酯254nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 浸泡時(shí)間的選擇 取同一批樣品約1g(4份)，試驗(yàn)分別浸泡0，30，60，120min后同供試品測(cè)定方法測(cè)定含量，結(jié)果分別為3.51，3.68，3.76，3.77mg/粒，表明供試品浸泡60min即可提取完全。

3.3 超聲時(shí)間的選擇 取同一批樣品約1g(6份)，試驗(yàn)浸泡60min后分別超聲0，10，20，30，40，50min后同供試品測(cè)定方法測(cè)定含量，結(jié)果分別為3.49，3.62，3.70，3.76，3.76，3.77mg/粒，表明供試品超聲30min即可提取完全。

3.4 洗脫體積的選擇 取同一批樣品約1g(3份)，試驗(yàn)甲醇洗脫體積分別為10,15,20mL，其它同供試品測(cè)定方法分別測(cè)定含量，結(jié)果分別為3.67，3.76，3.76mg/粒，表明15mL即可洗脫完全。

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