松油烯4醇體內外對人肺癌細胞系A-549增殖抑制作用

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(1.重慶醫(yī)科大學：a.病理科；b.神經科學研究中心，重慶 400016；2.重慶市日用化學工業(yè)研究所，重慶 400065)

松油烯4醇是一種存在于多種植物精油中的單萜類化合物，具有多種生物活性。研究發(fā)現(xiàn)含有該種成分的精油具有抗菌、抗炎、除螨、鎮(zhèn)咳、抗氧化、抗腫瘤等活性，已經被用于治療口腔潰瘍、牙齦炎、牙根管炎、手足癬以及皮膚感染等疾病，同時也用作護膚品的原料，可減少痤瘡引起的紅腫等[1-3]。但目前國內外針對松油烯4醇單體的研究還鮮有報道，本實驗希望通過松油烯4醇對肺癌細胞株A-549增殖抑制作用及可能的作用機制的研究為肺癌及其他腫瘤化療提供一個新的選擇。

1 材料與方法

1.1 細胞株及實驗動物

人細支氣管肺泡癌細胞株 A-549由重慶醫(yī)科大學病理科惠贈；SPF級BALB/c-nu裸小鼠21只購至重慶醫(yī)科大學實驗動物中心，4～5周齡，體質量15～19 g，雌雄不限，動物飼養(yǎng)合格證號:SCXK[渝]2007-0001。

1.2 主要試劑

標準胎牛血清(HyClone公司)；DMEM 培養(yǎng)基(高糖型，HyClone 公司)；0.25%胰蛋白酶(HyClone公司)；MTT(北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司)；CCK8(碧云天生物技術研究所)；松油烯4醇(西亞試劑，純度大于或等于98%)。

1.3 細胞培養(yǎng)、動物飼養(yǎng)及藥品配制

將A549細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM高糖完全培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中加入青霉素100 U/mL和鏈霉素100 Lg/mL。將細胞置于37 ℃，5%CO2孵箱中在飽和濕度下培養(yǎng)，隔日換液1次，每3天以1∶2正常傳代培養(yǎng)1次，采用0.25%胰蛋白酶消化細胞。裸鼠實驗和飼養(yǎng)均在重慶醫(yī)科大學動物實驗中心恒溫、恒濕的 SPF 動物房進行，12 h 晝夜節(jié)律，裸鼠可以自由進食和飲水。松油烯4醇以11 ul加入5.5 mL培養(yǎng)液中配成0.2%v/v的母液使用時按比例稀釋成0.02%～0.1% v/v工作液。過濾除菌分裝后4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 MTT法檢測細胞增殖抑制及IC50

將密度為1×104/mL的A549細胞接種于 96 孔板中過夜，每孔100 μl，加入含不同濃度油烯4醇(0、0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.1%v/v)的培養(yǎng)液(200 μl/孔)培養(yǎng)24 h后，每孔加入20 μl的MTT(5 mg/mL用PBS 配制，pH 7.5)。繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸出廢液，每孔加入150 μl DMSO，于60 r/min的搖床中振蕩10 min。在490 nm波長處用酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔的光吸收值。計算抑制率:抑制率=[1-處理組D(490)值/對照組D(490)值]×100% ，再計算半數(shù)抑制濃度(IC50)。

1.5 實驗分組

根據(jù)MTT實驗結果將A-549細胞分為對照組和實驗組，對照組用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，實驗組分為0.04%、0.06%、0.08%(v/v)組分別以含有相應濃度的松油烯4醇的培養(yǎng)基培養(yǎng)。將21只裸鼠按隨機數(shù)目表隨機分為實驗組(0%v/v)、低劑量組(0.06%v/v)、高劑量組(0.08%v/v)。

1.6 CCK-8 比色分析法繪制生長曲線

取對數(shù)生長A-549 細胞按(每孔1×103)接種于五塊96孔板中，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)隔夜貼壁后，加入含松油烯4醇(0、0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%v/v)的培養(yǎng)液(每孔200 μl)，邊緣孔以PBS填充，同時設置空白孔(培養(yǎng)基CCK-8，無細胞)，每組設5復孔，每隔24 h取出一塊每孔加入10 μLCCK-8溶液，4 h后測定450 nm各孔的吸光度值，連測5 d。以時間為橫軸，每天的吸光度值為縱軸繪制生長曲線。實驗重復3次。

1.7 透射電鏡觀察細胞超微結構改變

細胞培養(yǎng)24 h后用胰酶消化PBS洗滌1次后，將細胞懸液轉移到EP管中以1 200 r/min離心10 min。吸棄上清液，沿管壁緩慢加入預先配制好的固定液，4 ℃保存過夜后送電鏡室，用 HITACHI-7500透射電鏡觀察各組細胞的超微結構變化。

1.8 細胞周期及凋亡檢測

取對數(shù)生長期A-549細胞按5×105個/孔的濃度接種于六孔板中。培養(yǎng)箱內培養(yǎng)過夜貼壁后棄上清，加入無血清DMEM高糖培養(yǎng)液，饑餓同步18 h，使細胞停滯于G0期。按分組方法分組培養(yǎng)24 h后，收集上清液細胞；0.25%胰酶-EDTA消化，1 000 r/min離心10 min，收集貼壁細胞，PBS洗滌2次，1 000 r/m離心10 min。在檢測細胞凋亡的試管中先后加入1×Buffer 100 mL，AV染液5 μL，PI染液1 μL，避光15 min，再加入1×Buffer 400 μL，上機檢測；檢測周期細胞加入70%冷乙醇在4 ℃固定12 h后在試管中加入1 mL的DNA染色劑，避光30 min，上機檢測。用隨機軟件進行數(shù)據(jù)分析，每組重復3次。

1.9 細胞內鈣離子濃度測定

對數(shù)生長期的A-549細胞按分組方法分組培養(yǎng)24 h，1 000 r/min，離心5 min。洗滌后，在結合緩沖液中，加入終濃度為5 μmol·L-1的Flou-3/AM，，置CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h后反復洗滌后用流式細胞儀檢測各組熒光強度，激發(fā)波長488 nm。每組重復3次。

1.10 BALB/C(nu/nu)裸小鼠體內移植瘤建立

將肺癌A-549細胞按常規(guī)方法培養(yǎng)，消化離心收集后，臺盼藍染色活細胞計數(shù)大于99%，計數(shù)并調整細胞濃度為5×106個/mL。用帶6號針頭注射器抽取癌細胞懸液接種于裸鼠右前腋部皮下，每個部位接種 0.2 mL(含活細胞數(shù)1×106個)，接種后每天觀察有無腫瘤形成及注射點有無破潰紅腫，經過3～7 d潛伏期，可見接種部位皮下出現(xiàn)瘤結節(jié)，并逐漸長大，呈圓形或橢圓形突出于體表，以腫瘤直徑0.5 cm為成瘤。

1.11 治療后抑瘤率的測定

按分組方法將21只裸小鼠按隨機數(shù)目表隨機分為對照組、低劑量組、高劑量組，以相應藥物濃度進行腹腔注射給藥，每只每天0.1 mL，治療10 d后脫頸處死，分離瘤組織測量其長短徑和重量，移植瘤的體積按公式:V(mm3)=πab2/6計算。根據(jù)治療結束后移植瘤瘤質量及體積計算各組平均瘤質量及平均瘤體積。通過各組平均瘤質量計算抑瘤率( inhibition ratio，IR)。IR=(對照組平均瘤質量-治療組平均瘤質量)/對照組平均瘤質量×100%。

1.12 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 松油烯4醇對A-549細胞增殖抑制影響及IC50

不同濃度的松油烯4醇作用A-549細胞株24 h后，從松油烯4醇濃度0.02%v/v開始對細胞株的生長均有抑制作用，與對照組相比，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，并呈濃度依賴性(圖1)。運用SPSS 17.0分析計算A-549細胞株24 h的IC50為0.067%v/v。

*：與對照組比較，P<0.05；#：與對照組比較，P<0.01

2.2 不同濃度松油烯4醇對A-549細胞生長曲線的影響

根據(jù)5 d的CCK8結果來繪制生長曲線，結果顯示給藥組生長曲線明顯較對照組平緩，表明松油烯4醇對A-549細胞的抑制作用呈時間、劑量依賴性(圖2)。

*：與對照組比較，P<0.05；#：與對照組比較，P<0.01

2.3 松油烯4醇對A549細胞超微結構的影響

透射電鏡觀察顯示：未用松油烯4醇處理的細胞可見到少量自噬空泡(圖3a)，松油烯4醇處理24 h后的細胞內可見大量自噬空泡、擴張的內質網等(圖3b、c、d)。

a：空白對照組；b：0.04組；c：0.06組；d：0.08組

圖3不同濃度松油烯4醇作用與A549細胞后透射電鏡觀察細胞超微結構改變情況

2.4 A-549細胞周期分布、凋亡、細胞內Ca2+濃度、細胞 膜電位水平測定

2.4.1 A-549細胞周期分布測定 實驗結果顯示不同濃度松油烯4醇處理細胞24 h后，藥物組與對照組比較，松油烯4醇能降低A-549細胞的G1期細胞的比例，升高G2期和S期細胞比例，呈現(xiàn)G2期和S期阻滯作用，并呈劑量依賴性，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1、圖4。

2.4.2 肺癌A-549細胞凋亡檢測 與空白對照組相比，經藥物處理24 h后的細胞凋亡的比例均有明顯升高，且晚期凋亡的比例呈現(xiàn)一定的劑量-效應關系，見表2、圖5。

2.4.3 A-549細胞內鈣離子濃度測定 不同藥物濃度作用24 h后，各藥物干預組細胞內Ca2+熒光強度均明顯高于正常對照組，且隨著藥物濃度的增加而增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2、圖6。

2.5 松油烯4醇對肺癌裸鼠移植瘤生長的影響

治療結束時對照組移植瘤體積及平均瘤質量，見表3、圖7。各組移植瘤平均體積和平均質量相互比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。計算高、低劑量的松油烯4醇對肺癌裸鼠移植瘤生長抑制率分別為53.33%和77.46%。

表1 松油烯4醇對A-549細胞周期的影響

*：與對照組比較，P<0.05；#：與對照組比較，P<0.01

a：空白對照組；b：0.04組；c：0.06組；d：0.08組

分組總凋亡率(%)Ca2+熒光強度對照組1.18±0.16100.30±12.750.04組8.43±0.51*129.7±0.96△0.06組33.75±0.65*781.78±9.24#0.08組44.32±2.35*1014.2±83.47#

*：與對照組比較，P<0.05；#：與對照組比較，P<0.01；△：與對照組比較，P>0.05

a:對照組；b:0.04%組；c:0.06%組；d:0.08%組

5AnnexinV-FITC/PI雙染流式細胞儀分析松油烯4醇處理

A-549細胞后細胞凋亡情況

a:對照組；b：0.04組；c：0.06組；d：0.08組

6不同藥物濃度作用于A-549細胞后細胞內Ca2+濃度改變情況

表3 各組裸鼠移植瘤體積、瘤質量及抑制率

*：與對照組比較，P<0.05；#：與對照組比較，P<0.01

a:對照組;b:低劑量組;c:高劑量組

3 討論

肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，隨著我國人口老齡化的加劇，經濟快速發(fā)展帶來的環(huán)境污染以及吸煙率居高不下等原因，肺癌已成為我國城市人口惡性腫瘤死亡原因的第一位[4-5]?；熌壳笆欠伟┨貏e是中晚期肺癌最有效的治療方法之一。然而傳統(tǒng)的肺癌化療藥物常因嚴重損害人體正常組織細胞而使臨床應用受到限制[6-7]。人們期望一種既能抗腫瘤，又不過多損害機體正常組織的新化療藥物的出現(xiàn)。

本實驗用人非小細胞肺癌細胞株A-549以及BALB/C裸小鼠移植瘤研究了松油烯4醇對人肺癌的體外及體內作用及其機制。MTT、CCK8以及體內抗移植瘤實驗顯示與對照組相比，松油烯4醇在0.02%～0.1%v/v濃度范圍內對A-549細胞均有明顯抑制作用，且呈劑量依賴和時間依賴性的關系。

細胞增殖即是細胞周期循環(huán)的過程，因此細胞增殖的抑制既是細胞周期循環(huán)停滯的結果。腫瘤細胞的增殖動力學特點表現(xiàn)為細胞群體分布主要與DNA合成活躍的S期有關，細胞一旦進入此期，如無特殊干擾，便能按細胞周期的順序發(fā)展下去，直至重新回到G1期。本研究通過流式細胞儀分析細胞周期表明，不同濃度松油烯4醇處理細胞24 h后，藥物組與對照組比較劑量依賴性的降低G1期細胞的比例，升高S期細胞比例，使細胞呈現(xiàn)S期阻滯。

腫瘤的發(fā)生不僅與細胞的異常增殖和分化有關，也與細胞程序性死亡功能紊亂有關。細胞程序性死亡是指機體在生長、發(fā)育以及受到外來刺激時清除多余、衰老或受損傷的細胞以保持機體內環(huán)境平衡和維持正常生理活動過程的一種自我調節(jié)機制。正常生命個體每天有數(shù)以億計的細胞誕生，同時又有數(shù)以億計的細胞程序性死亡，兩者處于一種動態(tài)平衡，一旦失衡就可能導致腫瘤的發(fā)生。細胞凋亡和自噬被稱為Ⅰ型和Ⅱ程序性細胞死亡，目前使用的大多數(shù)化療藥物就是通過誘導細胞凋亡和自噬而達到殺滅腫瘤細胞作用的[8-11]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)松油烯4醇具有誘導A549細胞凋亡和自噬增強的作用。

很多文獻指出，凋亡以及自噬過程與線粒體有著非常密切的關系，而線粒體是細胞內的鈣庫，調節(jié)著細胞內Ca2+的平衡[12-14]。故本實驗用流式細胞技術檢測了藥物處理后細胞內Ca2+濃度改變情況，發(fā)現(xiàn)給藥組Ca2+濃度升高并呈劑量依賴性 ，說明在細胞程序性死亡過程中，Ca2+可能也參與其中，并發(fā)揮了一定的作用，但有關它們之間具體的聯(lián)系還有待進一步的研究。

總之，本實驗證實松油烯4醇具有抑制人肺癌A-549細胞增殖的作用，并呈一定的劑量依賴性和時間依賴性，其可以阻止A-549細胞周期，并誘導細胞發(fā)生凋亡和自噬，誘導凋亡和自噬的途徑可能與細胞內Ca2+超載相關。至于松油烯4醇抑制A-549細胞增殖阻滯細胞周期以及誘導凋亡和自噬的確切機制仍需后期研究進一步證實。

[參考文獻]

[1] Tighe S，Gao YY，Tseng SC.Terpinen-4-ol is the Most Active Ingredient of Tea Tree Oil to Kill Mites[J].Transl Vis Sci Technol，2013，2(7):2-8.

[2] Furneri PM，Paolino D，Saija A，et al.In vitro antimycoplasmal activity of Melaleuca alternifolia essential oil[J].J Antimicrob Chemother，2006，58(3):706-707．

[3] Cox SD，Mann CM，Markham JL，et al.The mode of antimicrobial action of the essential oil of Melaleuca altenifolia (tea tree oil)[J].J Appl Microbiol,2000，88(1):170-175 .

[4] 吳鵬昌，張 偉.茶樹油的研究進展[J].綜述報告，2009，18(3):61-62

[5] 陳仁杰，張金良，闞海東.中國大氣污染與肺癌關系的流行病學研究回顧[J]．衛(wèi)生研究，2011，40(2):243-245．

[6] 陳萬青，張思維，鄒小農.中國肺癌發(fā)病死亡的估計和流行趨勢研究[J]．中國肺癌雜志，2010，13(5):488-493．

[7] Lúcio KA, Rocha Gda G, Mon??o-Ribeiro LC,，et al.Oleanolic acid initiates apoptosis in non-small cell lung cancer cell lines and reduces metastasis of a B16F10 melanoma model in vivo[J].PLoS One，2011，6(12):e28596.

[8] Fu ZY，Han JX，Huang HY.Effects of emodin on gene expression profile in small cell lung cancer NCI-H446 cells[J].Chin Med J (Engl)，2007，120(19):1710-1715．

[9] Mathew R，Karantza-Wadsworth V，White E.Role of autophagy in cancer[J].Nat Rev Cancer，2007，7(12):961-967.

[10] Li J，Hou N，F(xiàn)aried A，et al.Inhibition of autophagy augments 5-fluorouracil chemotherapy in human colon cancer in vitro and in vivo model[J].Eur J Cancer，2010，46(10):1900-1909.

[11] Lockwood TD，Minassin IA.Protein turnover and proliferation.Failure of SV-3T3 cells to increase lysosomal proteinases，increase protein degradation and cease net protein accumulation[J].Biochem J，1982，206(2):251-258.

[12] Cao Y，Klionsky DJ.Physiological functions of Atg6/Beclin 1: a unique autophagy-related protein[J].Cell Res，2007，17(10): 839-849.

[13] Guo WJ，Ye SS，Cao N，et al.ROS-mediated autophagy was involved in cancer cell death induced by novel copper(II) complex[J].Exp Toxicol Pathol，2010，62(5):577-582.

[14] Rodriguez-Enriques S，He L，Lemasters JJ.Role of mitochondrial permeability transition pores in mitochondrial autophagy[J].Int J Biochem Cell Biol，2004，36(12):2463-2472.