Goniurosaurus indet.的有效性及中國瞼虎屬(Squamata: Sauria: Eublepharidae)種間的親緣關(guān)系

張 潔, 慶 寧*, 易祖盛, 王英勇, 江曉汕, 盧文華, James Lazell

(1.華南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 廣東省高等學(xué)校生態(tài)與環(huán)境科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣東省水產(chǎn)健康安全養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣州 510631；2.廣州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 廣州 510006；3.中山大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生物博物館, 廣州 510275；4.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510642；5.美國羅德島州生物保護(hù)所, RI 02835，美國)

瞼虎屬(Goniurosaurus)動物隸屬爬行綱(Reptilia)有鱗目(Squamata)蜥蜴亞目(Sauria)瞼虎科(Eublepharidae), 原隸屬壁虎科(Geckonidae). 多生活于溪流或河流岸邊的石縫或洞中, 晝伏夜出, 行動遲緩, 以小型無脊椎動物為食. 目前全世界瞼虎屬(Goniurosaurus)共有14種, 主要分布于東亞南部, 中國現(xiàn)已命名的瞼虎有6種[1]. 依據(jù)李德俊等[2]的報(bào)道, 中國動物志[3]上僅記載里氏瞼虎Goniurosauruslichtenfelderi(Mocquard)[4]一種. 但是, 近年來在中國境內(nèi)分布的瞼虎種類研究有所進(jìn)展[5], 不僅證實(shí)海南瞼虎G.hainanensisBarbour[6]不同于G.lichtenfelderi, 而且又相繼發(fā)現(xiàn)了4個新種: 憑祥瞼虎G.luii[7]、霸王嶺瞼虎G.bawanglingensis[8]、英德瞼虎G.yingdeensis[9]、荔波瞼虎G.liboensis[1]. 之前發(fā)現(xiàn)的廣東新記錄的瞼虎屬未定種Goniurosaurusindet.[10]和英德瞼虎G.yingdeensis的發(fā)現(xiàn)地點(diǎn)距離不遠(yuǎn), 僅以珠江水系北江的最大支流連江一河相隔, 體色、花紋以及背部橫紋的數(shù)目也相似, 但在生境和其它形態(tài)上卻有明顯的差異. 前者生活于洞穴, 后者生活于靠近村落建筑物的隙縫; 特別是前者成年雌性沒有肛前孔而后者卻有, 背部橫紋的顏色和寬窄不同, 以及第四趾下瓣數(shù)量不同等. 因此, 本文重點(diǎn)研究這兩者之間的遺傳差異和它們與瞼虎屬其它種類的親緣關(guān)系.

在系統(tǒng)發(fā)育研究中, 常用貝葉斯演繹法(bayesian inference, BI)[11]、最大似然法(maximum likelihood, ML)[12]、最大簡約法(maximum parsimony, MP)[13-14]、鄰接法(neighbor-joining, NJ)[15]來分別構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹. Ota等[16]依據(jù)線粒體(mtDNA: 12S rRNA及16S rRNA)分子數(shù)據(jù)建立了瞼虎科的NJ系統(tǒng)樹, 認(rèn)為所有日本種類聚為一支并形成G.kuroiwae單系群. Grismer等[7]基于形態(tài)學(xué)，初步建立了當(dāng)時(shí)已知瞼虎種類的親緣關(guān)系，4條背部橫紋(包含nuchal loop)是祖征(pleisiomorphic), 具此特征的種類形成單系群(monophyletic), 其中里氏瞼虎G.lichtenfelderi與海南瞼虎G.hainanensis形成單系之后, 再與日本的G.kuroiwae單系形成一支; 具有5條背部橫紋的憑祥瞼虎G.luii與蛛紋瞼虎G.araneus形成單系之后, 再與海南島的霸王嶺瞼虎G.bawanglingensis形成另一支. 在這些基礎(chǔ)上, 利用形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)、生理學(xué)特征、分子數(shù)據(jù)(12S rRNA及16S rRNA)所得到的瞼虎科MP系統(tǒng)樹[17]與早期的結(jié)果基本一致. 利用4種mtDNA基因片段(12S rRNA、16S rRNA、完整ND2及其側(cè)翼基因)對瞼虎科已知物種及壁虎科部分物種進(jìn)行分析所得的BI系統(tǒng)發(fā)育樹[18]則不盡相同, 其中G.luii與G.araneus先聚成單系后再與G.lichtenfelderi聚成一支, 最后才與G.kuroiwae單系聚成瞼虎科的整個分支. Wang等[1]最近利用16S rRNA所得的BI、ML、MP系統(tǒng)發(fā)育樹與早期的形態(tài)學(xué)及分子數(shù)據(jù)的結(jié)果存在重要的分歧, 完全不同于上述所有研究，認(rèn)為具有4條背部橫紋的種類形成單系群的結(jié)論.

本文結(jié)合前人研究的結(jié)果, 利用mtDNA的12S rRNA和16S rRNA基因片段序列差異進(jìn)行分析, 比較BI、ML、MP、NJ四種系統(tǒng)發(fā)育分析方法的結(jié)果,探討Goniurosaurusindet.是否為有效種, 建立了我國瞼虎屬的系統(tǒng)發(fā)育樹, 為世界瞼虎屬的系統(tǒng)發(fā)育和分類研究補(bǔ)充了基礎(chǔ)資料和理論依據(jù), 也為物種保護(hù)和瀕危評估提供了重要的參考數(shù)據(jù).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

共有8個瞼虎樣品用于檢測mtDNA的12S rRNA和16S rRNA基因片段序列, 包括廣東省瞼虎屬新記錄Goniurosaurusindet.的3個個體、英德瞼虎G.yingdeensis的3個個體、華南師范大學(xué)(SCNU)動物標(biāo)本室收藏的海南瞼虎G.hainanensis的2個個體(表1). 從Genbank上獲取了含12S rRNA和16S rRNA的僅有的9個瞼虎mtDNA序列, 并以大壁虎Gekkogecko作為外類群(表1).

表1 瞼虎屬及其外類群樣品信息及Genebank線粒體基因片段登錄號

1.2 基因組DNA擴(kuò)增和測序

采用上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司購買的基因組DNA抽提試劑盒及其所示方法進(jìn)行DNA的提取. 用于擴(kuò)增12S rRNA及16S rRNA序列的特異引物[18]分別是Gec12S-1L (5′-CCTAGAGGAGCCTGTCCTATAA-3′), 12SB-H (5′-CAGAGGGTGACG-GGCGGTGTGT-3′)和16S-5L (5′-GGTMMYGCCTGCCCAGTG-3′), 16SBR-H (5′-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3′). 用于擴(kuò)增12S rRNA及16S rRNA基因片段序列的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的25 μL體系包括PCR Master Mix 12.5 μL (含MgCl2、dNTP Mix、Taq 酶)、上下游引物各1.0 μL (ng/μL)、DNA樣品1.0 μL, 用ddH2O補(bǔ)足25 μL. 反應(yīng)程序包括94 ℃預(yù)變性4 min, 然后進(jìn)行35個循環(huán), 每個循環(huán)包括94 ℃變性30 s, 55 ℃退火30 s, 72 ℃延伸1 min, 最后72 ℃延伸8 min, 4 ℃保存. PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖電泳檢測樣品擴(kuò)增情況, 然后送至上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成純化和測序.

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用DNABASER 2.91.5軟件(http://www.dnabaser.com)和CLUSTAL X 1.81軟件[19]對序列進(jìn)行比對, 輔以人工校正. 利用MEGA 5.0軟件[20]計(jì)算分子多樣性參數(shù)(如多態(tài)位點(diǎn)個數(shù)、轉(zhuǎn)換顛換比例), 并利用其中的雙參數(shù)法[21]計(jì)算種間、種內(nèi)遺傳距離. 使用PAUP 4.0b10軟件[22]中的ML、MP、NJ分別構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹. ML、MP、NJ均采用啟發(fā)式搜索(heuristic search), TBR (tree bisection reconnection)枝長交換, 1 000次抽樣自展(bootstrap)來分析評估系統(tǒng)發(fā)育各分支的支持率, 對其中所有核苷酸位點(diǎn)不進(jìn)行加權(quán)處理, 位點(diǎn)空位亦視為缺失狀態(tài). 在構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹前, 還對兩個mtDNA基因片段進(jìn)行分劃同質(zhì)性檢驗(yàn)(partition homogeneity test)[23], 評價(jià)片段序列聯(lián)合分析的可靠性, 結(jié)果(p=0.124)顯示兩個基因片段可以進(jìn)行聯(lián)合分析. 采用MRBAYES 3.1.2軟件[11]構(gòu)建BI樹, 其中MCMC(Markov Chain Monte Carlo)算法以隨機(jī)樹為起始樹, 運(yùn)行1 000 000代, 每100代取樣1次, 開始的2 500個樣本作為老化樣本(burn-in)舍棄. 在用BI、ML、NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹之前, 先用MRMODELTEST 3.7軟件[24]獲得最適合本研究序列矩陣的核苷酸替代模型及相關(guān)參數(shù), 在AIC標(biāo)準(zhǔn)下(Akaike information criterion)[25], 12S rRNA和16S rRNA基因片段聯(lián)合數(shù)據(jù)的模型為GTR+G.

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA序列特征

經(jīng)軟件比對輔以人工校正后, 共獲得瞼虎屬Goniurosaurus和大壁虎Gekkogecko17個樣品的12S rRNA序列共385 bp, 16S rRNA序列共477 bp, 2個基因片段合并后序列共為862 bp; 其中核苷酸變異位點(diǎn)388, 簡約信息位點(diǎn)269. 堿基T、C、A和G的平均含量分別為21.8%、24.9%、35.0%和18.3%, 轉(zhuǎn)換顛換比為1.07.

2.2 遺傳距離特征

依據(jù)Kimura雙參數(shù)法所得的凈遺傳距離(表2)顯示瞼虎屬Goniurosaurus種間遺傳距離為0.011～0.295, 其中瞼虎屬未定種Goniurosaurusindet.與英德瞼虎G.yingdeensis之間的遺傳距離為0.044～0.046, 而內(nèi)外類群之間的遺傳距離則較遠(yuǎn), 均介于0.302～0.412. 海南瞼虎G.hainanensis與瞼虎屬其它物種的種間遺傳距離較大, 均介于0.250～0.295, 接近外類群大壁虎Gekkogecko與瞼虎屬Goniurosaurus之間遺傳距離的下限.

表2 瞼虎屬線粒體基因片段12S rRNA和16S rRNA聯(lián)合數(shù)據(jù)的種間和種內(nèi)遺傳距離(下三角)及標(biāo)準(zhǔn)誤差(上三角)

2.3 系統(tǒng)發(fā)育和物種親緣關(guān)系

以2個基因片段的聯(lián)合數(shù)據(jù)采用MP和NJ法分別構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基本一致(圖1A). 瞼虎屬Goniurosaurus的17個個體由3個主分支構(gòu)成; 主分支a僅包含海南瞼虎G.hainanensis;G.kuroiwae類群形成單系后與在地理上相距較遠(yuǎn)的里氏瞼虎G.lichtenfelderi共同聚成主分支b; 主分支c由2個單系構(gòu)成, 瞼虎屬未定種Goniurosaurusindet.與英德瞼虎G.yingdeensis形成單系后, 再與由憑祥瞼虎G.luii和蛛紋瞼虎G.araneus形成的單系聚成主分支c. 具有4條背部橫紋的G.hainanensis、G.lichtenfelderi和日本的G.kuroiwae類群位于樹的根部, 表現(xiàn)祖征性狀.

以2個基因片段的聯(lián)合數(shù)據(jù)采用ML法所建的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1B)與MP和NJ法所建的系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果略有不同. 雖然也形成3個主分支, 其中主分支a與MP和NJ樹相似, 均僅由海南瞼虎G.hainanensis個體構(gòu)成, 但是主分支b和c不盡相同. 日本的G.kuroiwae類群獨(dú)自構(gòu)成主分支b; 里氏瞼虎G.lichtenfelderi脫離MP和NJ樹的主分支b, 構(gòu)成主分支c的2個亞分支之一; 另一個亞分支與MP和NJ樹的主分支c基本一致. 系統(tǒng)發(fā)育樹也顯示具4條背部橫紋是祖征.

以2個基因片段的聯(lián)合數(shù)據(jù)采用BI法所建的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1C)與其它3種方法構(gòu)建樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)也不盡相同. MP和NJ樹的主分支c中的2個單系關(guān)系保持不變, 其中瞼虎屬未定種Goniurosaurusindet.與英德瞼虎G.yingdeensis這一單系在此構(gòu)成主分支c, 而憑祥瞼虎G.luii和蛛紋瞼虎G.araneus這一單系在此構(gòu)成主分支b. 主要不同于上述ML、MP、NJ結(jié)果的是具有4條背部橫紋類群的親緣關(guān)系; 海南瞼虎G.hainanensis沒有單獨(dú)構(gòu)成一個主分支, 而是同里氏瞼虎G.lichtenfelderi和日本的G.kuroiwae類群共同聚為主分支a, 但是系統(tǒng)發(fā)育樹也顯示具4條背部橫紋的種類形成單系群.

3 討論

3.1 廣東新紀(jì)錄的瞼虎屬未定種Goniurosaurus indet.及其親緣關(guān)系

由BI、ML、MP、NJ 4種方法所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)均顯示瞼虎屬未定種Goniurosaurusindet.與英德瞼虎G.yingdeensis構(gòu)成姐妹支, 首次揭示二者親緣關(guān)系最近. 這2個廣東新種類[9-10]分布區(qū)域相同, 環(huán)境地貌相似, 均為喀斯特石灰熔巖, 多巖洞和石縫, 利于瞼虎生存和隱藏. 但是, 它們兩者之間的遺傳距離(0.044～0.046)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于各自種內(nèi)個體間的遺傳距離(0.000～0.002), 并且與分類地位已經(jīng)明確的蛛紋瞼虎G.araneus與憑祥瞼虎G.luii兩種之間的遺傳距離(0.051)接近(表2), 也接近新種荔波瞼虎G.liboensis與G.luii兩種之間的遺傳距離(0.043)[1]. 雖然Goniurosaurusindet.與英德瞼虎G.yingdeensis兩者的地理分布距離較近, 采集地僅相距約62 km, 但是兩地之間有寬闊的連江干流相隔. 連江是珠江水系中北江的最大支流, 珠江及其主要支流的形成可以追溯到至今約1億年前的中生代上白堊紀(jì)[26]. 我們推測寬闊的水域可能造成地理屏障, 致使瞼虎長時(shí)間不能沿著山嶺擴(kuò)散, 彼此隔離不能進(jìn)行基因交流, 逐漸適應(yīng)了不同的生境, 導(dǎo)致連江兩岸的瞼虎發(fā)生分化. 再結(jié)合兩者在形態(tài)上已有的顯著差異(體色、第四趾下瓣數(shù)量、雌性肛前孔有或無)[9-10], 我們認(rèn)為Goniurosaurusindet.有可能是瞼虎屬新種, 與英德瞼虎G.yingdeensis構(gòu)成姐妹種, 成為G.luii類群的新成員.

圖1 基于瞼虎屬Goniurosaurus線粒體基因片段12S rRNA及16S rRNA聯(lián)合數(shù)據(jù)而構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹及其3個主分支a、b、c內(nèi)外的支持率

3.2 地理親緣關(guān)系

Grismer等[7-8]將瞼虎分為3個類群(group), 分別是G.lichtenfelderi類群、G.kuroiwae類群和G.luii類群; 前2個類群的種類在形態(tài)上均具有4條背部橫斑紋, 后一類群的種類則具有5條背部橫斑紋. 我國的瞼虎種類中, 里氏瞼虎G.lichtenfelderi和海南瞼虎G.hainanensis屬于G.lichtenfelderi類群;G.luii類群包括憑祥瞼虎G.luii、霸王嶺瞼虎G.bawanglingensis、英德瞼虎G.yingdeensis、荔波瞼虎G.liboensis和未定種Goniurosaurusindet. 由BI、ML、MP、NJ 4種方法所得的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)均支持在G.luii類群中, 憑祥瞼虎G.luii和蛛紋瞼虎G.araneus的關(guān)系較為密切, 新發(fā)現(xiàn)的英德瞼虎G.yingdeensis和瞼虎未定種Goniurosaurusindet.的關(guān)系同樣如此. 這2對姐妹種類均分布于內(nèi)陸地區(qū)并彼此相鄰, 其親緣關(guān)系符合地理距離決定分化的規(guī)律.

由ML、MP、NJ三種方法所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)均支持具有4條背部橫紋是祖征(pleisiomorphic), 并且BI樹(圖1)也支持具有4條背部橫紋特征的種類形成單系群(monophyletic)這一長期的形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)結(jié)果[7,16-18]. 具有不同背部橫紋數(shù)目的種類沒有分別形成單系群的矛盾結(jié)果[1]可能與檢測樣品數(shù)目、基因片段長短、外類群的選用等都有關(guān)系; 后者僅采用了一個序列較短的基因片段, 其選用的外類群與瞼虎種間的遺傳距離重疊.

3.3 海南瞼虎Goniurosaurus hainanensis的特殊性

由BI、ML、MP、NJ 4種方法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)均顯示海南瞼虎G.hainanensis不但與瞼虎屬其它物種存在顯著的遺傳分化(沒有與其它任何瞼虎構(gòu)成姐妹支); ML、MP、NJ 3種方法所建的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)也均表明海南瞼虎G.hainanensis的系統(tǒng)發(fā)育地位最為原始(位于樹的底端); 其與瞼虎屬其它物種之間的遺傳距離之大甚至接近壁虎屬Gekko與瞼虎屬Goniurosaurus之間的遺傳距離(表2). 長期以來, 前人認(rèn)為G.hainanensis和里氏瞼虎G.lichtenfelderi形成單系[1,7,17]. 但是, 我們研究的結(jié)果與上述文獻(xiàn)不一致, 揭示了G.hainanensis獨(dú)特的系統(tǒng)發(fā)育和分類地位, 暗示海南島在瞼虎屬起源研究上的地理重要性.

4 結(jié)論

廣東新紀(jì)錄的瞼虎屬未定種Goniurosaurusindet.可能是新種, 其與英德瞼虎G.yingdeensis組成姐妹種, 成為瞼虎屬G.luii類群的一個新成員. 具4條背部橫紋是祖征, 具5條背部橫紋為衍征. 本文首次提出的“河流隔離”假說可能對進(jìn)一步解釋全球瞼虎屬物種的親緣地理分布格局具有重要意義. 瞼虎屬Goniurosaurus種類稀少, 分布較為狹窄, 中國境內(nèi)外相繼發(fā)現(xiàn)的部分新種和舊種之間的地理分布區(qū)重疊. 因此, 了解它們的地理親緣關(guān)系和系統(tǒng)地位十分必要, 也是瀕危評估、保護(hù)對策制定的基礎(chǔ). 同時(shí)由于非法寵物貿(mào)易的威脅, 國外大多數(shù)種類已經(jīng)列入各國的物種紅色名錄, 而目前中國物種紅色名錄[27]僅將憑祥瞼虎G.luii列入近危(NT)保護(hù)級別. 由此可見, 中國瞼虎屬研究在物種分化、生態(tài)學(xué)、親緣地理方面仍需進(jìn)一步深入, 為重點(diǎn)關(guān)注保護(hù)瞼虎奠定理論和應(yīng)用基礎(chǔ).

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