一種長時穩(wěn)定的鉛離子響應(yīng)型脫氧核酶的合成與表征

陳 詞，蒯海嵐，李林羚，胡 霞，楊基峰，張松柏

（湖南文理學(xué)院，化學(xué)與材料工程學(xué)院，水處理功能材料湖南省重點實驗室，電鍍廢水回用技術(shù)湖南省工程研究中心 湖南 常德 415000）

脫氧核酶是一類具有酶活性的核酸分子，1994 年首例鉛離子響應(yīng)的脫氧核酶被報道［1］，隨后顯現(xiàn)出其在生物化學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用研究潛力［2］，引起了研究者的廣泛關(guān)注。經(jīng)歷了近三十年的發(fā)展，目前脫氧核酶相關(guān)領(lǐng)域取得了較多的研究成果：一方面，脫氧核酶被廣泛應(yīng)用于生物傳感領(lǐng)域［3］，實現(xiàn)了對金屬離子、核酸、蛋白質(zhì)以及細菌等多種靶標的有效檢測［4］，例如Ye 等［5］利用金納米顆粒與脫氧核酶構(gòu)建了表面等離子體共振-散射（SPR- S）的分析平臺用于檢測鉛離子，其檢出限達10 fmol/L；另一方面，隨著脫氧核酶類型的不斷豐富，其介導(dǎo)的化學(xué)反應(yīng)不再局限于核酸底物，催化卟啉金屬化以及Diels-Alder環(huán)加成的脫氧核糖也有報道［6-7］。由此可見，脫氧核酶具有較強的應(yīng)用研究潛力，其在應(yīng)用研究中所面臨的問題值得進一步關(guān)注。

核酸分子易被各類核酸酶降解一直是功能核酸在生命健康相關(guān)研究領(lǐng)域應(yīng)用時所面臨的問題［8］，脫氧核酶作為一種功能核酸也不例外［4］。目前被報道較多且較為成熟的改進策略是對脫氧核酶的核酸結(jié)構(gòu)進行化學(xué)修飾，如甲氧基、倒T堿基修飾等［9-10］，這類策略在提升核酸分子耐酶切能力方面表現(xiàn)較好，且核酸分子結(jié)構(gòu)上存在較多可修飾位點［11］。但在基礎(chǔ)研究層面，化學(xué)修飾帶來的毒性及其對功能核酸結(jié)構(gòu)的影響仍不容小覷［12］，大部分化學(xué)修飾操作繁瑣且價格高昂，這也相應(yīng)地增加了研究成本。因此，進一步優(yōu)化化學(xué)修飾相關(guān)改進策略或者尋找新的改進策略仍受關(guān)注。本研究從尋找新的改進策略角度出發(fā)，結(jié)合課題組在環(huán)形功能核酸領(lǐng)域的相關(guān)研究成果，選取較為成熟的鉛離子響應(yīng)脫氧核酶為研究對象，以GR-5 序列為研究模型［13］，通過對其改造設(shè)計合成了環(huán)形GR-5 脫氧核酶（命名為CirnGR-5），并進一步探討了核酸環(huán)化策略對脫氧核酶催化活性與穩(wěn)定性的影響。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

島津UV2600紫外可見分光光度計，美國Bio-Rad 凝膠電泳儀，上海天能Tanon 5200化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)，日立F-7000 熒光分光光度計，雷磁PHS-3C PH 計，杭州佑寧G100 干式恒溫器，賽洛捷克MXS漩渦混合器，默克密理博MilliQ純水儀。

4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES，98%）、無水檸檬酸（99.5%）、乙酸鎂（98%）均購于安徽澤升科技有限公司；磷酸氫二鈉（分析純）、磷酸二氫鈉（分析純）均購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司，硝酸鉀（分析純）購于天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司，TMB（98%）購于薩恩化學(xué)技術(shù)（上海）有限公司；3%過氧化氫、二甲基亞砜（DMSO，分析純）購于西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；Hemin（98%）、乙酸鈉（99%）購于上海麥克林生化科技股份有限公司；核酸染料Gelstainred購于蘇州優(yōu)逸蘭迪生物科技有限公司，四甲基乙二胺（TEMED，>99%）購于長沙鼎國生物技術(shù)有限公司，30% 聚丙烯酰胺-甲叉雙丙混合液購于Biosharp 公司，無水乙酸鉛（99%）購于阿拉丁試劑（上海）有限公司，Tris（>99.9%）、6X 聚蔗糖凝膠上樣緩沖液 III（含二甲苯青、溴酚藍、Tris-HCl、EDTA）購于生工生物工程（上海）股份有限公司，胎牛血清（FBS）購于美國Zeta life公司。

蛋白酶類相關(guān)試劑：T4 DNA連接酶（T4連接酶）及其工作緩沖液、核酸外切酶Ⅰ（Exo Ⅰ）及其工作緩沖液、核酸外切酶Ⅲ（Exo Ⅲ）及其工作緩沖液均購于寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司（Takara Bio）。

核酸類試劑：委托生工生物工程（上海）股份有限公司進行合成與純化，且所購買的序列在使用前均通過紫外分光光度計進行濃度的再測定。實驗所用核酸序列如表1所示。

表1 實驗所用核酸序列名稱及其組成Table 1 The name and composition of the nucleic acid sequence used in the experiment

1.2 緩沖液的組成

①緩沖液A：10 mmol/L HEPES、50 mmol/L 乙酸鈉、5 mmol/L 乙酸鎂，pH 7.4；②緩沖液B：10 mmol/L Tris-HCl、50 mmol/L乙酸鈉、5 mmol/L 乙酸鎂，pH 7.4；③緩沖液C：10 mmol/L磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉、50 mmol/L 乙酸鈉、5 mmol/L 乙酸鎂，pH 7.4；④3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）顯色液：每1.1 mL TMB 工作緩沖液加入5 μL 3% 過氧化氫、16.5 μL 10 mg/mL TMB 溶液（DMSO 溶解）。其中TMB 工作緩沖液的組成為：50 mmol/L 磷酸二氫鈉、25 mmol/L 檸檬酸、20 mmol/L 硝酸鉀；TMB 溶液（溶劑：DMSO）組成為：10 mg/mL TMB；顯色時所用Hemin（血紅素）溶液：使用DMSO 配制100 mmol/L 的高濃度Hemin 溶液，使用時用水稀釋至實驗所需濃度，且現(xiàn)配現(xiàn)用。⑤其他類型緩沖液：不同HEPES 緩沖液中僅HEPES 濃度（10、20、50 mmol/L）不同，其他鹽離子加入量與緩沖液A 保持一致，其名稱分別為A1、A2、A3；不同pH（7.4、6.4、5.4）的50 mmol/L HEPES 緩沖液中其他鹽離子成分加入量與緩沖液A3保持一致，其名稱分別為A3-7.4、A3-6.4、A3-5.4。

1.3 環(huán)形GR-5脫氧核酶的合成與表征

未成環(huán)的nGR-5脫氧核酶核酸序列（待成環(huán)序列，如bf-Cir-nGR-5）以及能與之雜交并促進成環(huán)的序列Cir-as（輔助雜交序列）以一定的物質(zhì)的量之比（一般為1∶1，其中Cir-as 序列過量以保證雜交完全，本文使用比例為1∶4）稀釋至1×T4 連接酶緩沖液中，均勻混合后于95oC 保持5 min，隨后迅速轉(zhuǎn)移至冰浴并保持30 min，結(jié)束后加入適量T4 連接酶于4oC 保存過夜。酶連接操作步驟結(jié)束后，混合液再于80oC保持15 min進行酶失活處理（實驗時間與溫度可根據(jù)酶用量進行提升），隨后使用外切酶進行酶切以去除非成環(huán)序列，處理結(jié)束后的序列可用于進一步表征與使用。本研究的質(zhì)譜表征委托生工生物工程（上海）股份有限公司進行。由于合成的環(huán)形序列的吸光度值無法確定，其合成后的濃度仍等同于合成前的濃度，故后續(xù)對實驗結(jié)果進行分析時，需考慮濃度差帶來的影響。

1.4 核酸分子的外切酶酶切實驗

待酶切序列于1×Exo I緩沖液中稀釋至合適濃度，加入定量或過量的Exo Ⅰ與Exo Ⅲ，再將混合溶液放置37oC進行酶切，酶切操作結(jié)束后再將混合溶液轉(zhuǎn)入80oC保持15 min以完成酶失活處理（實驗時間與溫度可根據(jù)酶用量進行提升），所得溶液可用于下一步表征與使用。

1.5 脫氧核酶的酶切實驗

將脫氧核酶序列與酶切底物序列以特定濃度比例稀釋至緩沖液C 中并于95oC 保持5 min，隨后迅速轉(zhuǎn)移至冰浴并保持30 min，結(jié)束后加入特定濃度的鉛離子，在室溫條件下進行酶切。反應(yīng)結(jié)束后的混合溶液于4oC保存并用于后續(xù)表征。

1.6 核酸分子的凝膠電泳表征

通過聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）電泳對核酸分子進行表征，用于電泳的凝膠濃度有8%和12%兩種，電泳緩沖液為1×TBE，電泳電壓為110 V，電泳結(jié)束后使用Gelstainred 進行染色并于Tanon 5200化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進行成像。

1.7 熒光特性的表征

使用日立F-7000 對核酸序列的熒光特性進行表征，激發(fā)波長為488 nm（狹縫5.0 nm），發(fā)射波段為500~580 nm（狹縫2.5 nm），PMT電壓為700 V，掃描速率為240 nm/min。

1.8 基于G-四聯(lián)體/血紅素復(fù)合物的表征

待表征的核酸序列在指定緩沖液中稀釋至特定濃度，加入定量或過量的Hemin分子（本文使用的核酸與Hemin比例為1∶5），混合后于室溫保持10 min，隨后取10 μL混合液加入冰浴保存的TMB顯色液190 μL，充分混合后置于室溫避光顯色，通過肉眼觀察顯色情況。此外，顯色結(jié)果也可用紫外分光光度計進行測定。測定多個樣品時，為保證測定條件的一致性，需對樣本進行定時定點測定，且顯色液需置于冰浴保存與取用，掃描波長范圍為200~800 nm。

1.9 脫氧核酶的穩(wěn)定性表征

不同組成的脫氧核酶序列在指定溶液（含外切酶的緩沖液、自來水以及75%胎牛血清）中稀釋至2μmol/L，并分裝成10~30 μL 的小管，在特定時間段取出后于95oC 變性5 min，并置于-20oC 保存，所有樣本處理完畢后即可進行凝膠電泳表征。

2 結(jié)果與討論

2.1 Cir-nGR-5脫氧核酶的合成與表征

為更好地研究結(jié)構(gòu)環(huán)化對脫氧核酶活性的影響，同時避免序列環(huán)化引起的構(gòu)型變化造成nGR-5脫氧核酶活性完全喪失，本文采取在nGR-5序列的末端引入與酶切底物序列堿基個數(shù)相近的堿基數(shù)目實現(xiàn)對環(huán)化前序列bf-Cir-nGR-5的設(shè)計，其序列組成如圖1A所示。環(huán)形nGR-5脫氧核酶（Cir-nGR-5）則通過基于T4 連接酶的bf-Cir-nGR-5 環(huán)化方式合成，其成環(huán)方法流程如圖1B 所示，并進一步通過凝膠電泳實驗和質(zhì)譜實驗對合成結(jié)果進行表征。如圖1C 所示為Cir-nGR-5 脫氧核酶合成凝膠電泳表征實驗，通過對比Lane 4 與Lane 6 的條帶存在情況，可初步確認有目標環(huán)形條帶合成（圖1C 箭頭指向處）。進一步對Lane1和Lane 6的樣本進行質(zhì)譜表征（如圖1D 所示），兩個樣本的測定結(jié)果差值接近一個水分子的相對分子質(zhì)量，結(jié)合測定方法的誤差允許范圍，可確定Cir-nGR-5已被成功合成。

圖1 Cir-nGR-5的合成方法與表征Fig.1 The synthetic process and result characterization of Cir-nGR-5

2.2 nGR-5脫氧核酶系列序列酶活性的表征

為進一步探究序列環(huán)化對脫氧核酶活性的影響，本文從nGR-5脫氧核酶系列序列酶有無活性以及酶活性表現(xiàn)兩個角度進行探究，使用的酶切底物為nGR-5s（其組成見圖1A）、nGR-5whgs，并結(jié)合凝膠電泳實驗以及紫外、熒光以及比色等分析實驗手段進行結(jié)果表征。

2.2.1nGR-5脫氧核酶系列序列酶活性的表征nGR-5脫氧核酶系列序列酶活性情況可通過nGR-5s底物序列的酶切實驗進行表征，其酶切流程如圖2A所示，酶切結(jié)果使用凝膠電泳實驗進行表征。為保證底物序列與酶鏈充分結(jié)合，nGR-5、bf-Cir-nGR-5、Cir-nGR-5 三條序列分別以1∶2 的濃度比與底物序列nGR-5s 結(jié)合，底物序列nGR-5s 濃度為4 μmol/L；加入過量Pb2+（此處為40 μmol/L），室溫酶切2 h 后的結(jié)果如圖2B 所示。結(jié)果顯示Lane 3 與Lane 6 在箭頭所指位置的條帶均有缺失，這說明nGR-5與bf-Cir-nGR-5 均表現(xiàn)出對nGR-5s 的明顯酶切，但Cir-nGR-5 對應(yīng)的Lane 9 的條帶仍然可見，說明其酶切能力受到影響。隨后，通過進一步延長酶切時間（過夜），再次對結(jié)果進行表征（如圖2C），結(jié)果顯示nGR-5s能被酶切，說明nGR-5序列環(huán)化后的Cir-nGR-5序列仍保留了原始序列的酶活性。

圖2 基于凝膠電泳的nGR-5系列序列對nGR-5s酶切能力的表征Fig.2 The characterization of nGR-5s cut by nGR-5 series sequence through gel electrophoresis

結(jié)合已有文獻報道［13］，進一步對nGR-5s序列進行熒光基團修飾（修飾后序列為nGR-5s-FQ），并通過測定其酶切前后的熒光信號變化來表征nGR-5 序列與Cir-nGR-5 序列的酶活性情況，其中nGR-5序列與Cir-nGR-5 序列也需進行猝滅基團修飾，修飾后序列為nGR-5Q 與Cir-nGR-5Q’，其序列修飾情況以及酶切流程示意圖如圖3A 所示。在表征實驗中，由于Cir-nGR-5Q’序列合成時其序列含量有損失，故該酶切反應(yīng)中底物序列的加入無須過量，而是以1∶2 的濃度比與酶序列結(jié)合，底物序列nGR-5s-FQ 的實際濃度為0.5 mol/L，Pb2+濃度為10 mol/L，室溫酶切6 h 后的熒光表征結(jié)果如圖3B 所示，Pb2+的加入能明顯引起溶液熒光信號的增強，這也表明了nGR-5 序列與Cir-nGR-5 均具備一定的酶切活性。

圖3 基于熒光分光光度計的nGR-5Q系列序列對nGR-5s-FQ的酶切能力表征Fig.3 Characterization of nGR-5s-FQ cut by nGR-5Q series sequence through fluorescence spectrophotometer

2.2.2nGR-5 脫氧核酶系列序列酶活性表現(xiàn)的表征為進一步表征Cir-nGR-5 序列的酶活性表現(xiàn)，結(jié)合課題組研究基礎(chǔ)、實驗條件以及研究成本等的相關(guān)情況，選擇一條帶有G-四聯(lián)體的底物序列nGR-5whgs 開展相關(guān)實驗（其序列組成如圖4A 所示），并利用 G-四聯(lián)體的特點實現(xiàn)對實驗結(jié)果的可視化表征。

圖4 nGR-5whgs酶切實驗示意圖以及基于比色實驗的酶切條件優(yōu)化Fig.4 Schematic diagram of nGR-5whgs cleavage experiment and its condition optimizing by colorimetric experiment

值得注意的是，本實驗所引入的G-四聯(lián)體序列源自課題組研究發(fā)現(xiàn)的一條發(fā)夾結(jié)構(gòu)的Oxy28序列（相關(guān)研究數(shù)據(jù)尚未以研究論文的形式公開發(fā)表），該序列與Hemin 分子構(gòu)成的復(fù)合物的催化活性受到發(fā)夾結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的影響，且其影響源自發(fā)夾結(jié)構(gòu)上特定位置的A堿基（見圖4A中虛線部分），該堿基在發(fā)夾結(jié)構(gòu)形成后能與G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)靠近并促使其過氧化物酶活性增強，有助于表征nGR-5s 系列序列與底物的結(jié)合情況。

基于nGR-5whgs 底物序列的表征策略如圖4B 所示（圖中僅以nGR-5 序列為例，其他系列序列同理），nGR-5whgs 與酶鏈結(jié)合后，發(fā)夾結(jié)構(gòu)被打開，末端G-四聯(lián)體與Hemin 形成的復(fù)合物的過氧化物酶活性較低，當(dāng)被酶切后，釋放出hg序列后，其發(fā)夾結(jié)構(gòu)被恢復(fù)，進而與Hemin 形成的復(fù)合物的過氧化物酶活性增強。此外，nGR-5whgs 由于存在一段游離的末端長鏈，其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性受到影響，會進一步降低背景信號。依據(jù)以上思路，可通過酶切前后混合溶液的過氧化物酶活性變化，表征nGR-5系列脫氧核酶的酶活性表現(xiàn)。

為保證后續(xù)表征實驗的最佳效果，需對圖4B 中檢測方法進行條件優(yōu)化。本文主要對酶切反應(yīng)使用的緩沖液進行優(yōu)化，結(jié)合不同文獻報道［14-17］，考察了3 類常見的緩沖液類型（分別為HEPES、Tris 與PBS）以及緩沖液組成（緩沖液濃度與pH 值）對顯色效果的影響。優(yōu)化實驗使用不含rA 堿基但序列組成一致的whg 序列和hg 序列模擬酶切反應(yīng)前后的底物組成，并通過對比二者顯色差異實現(xiàn)優(yōu)化表征。表征結(jié)果如圖4C所示，表明后續(xù)實驗緩沖液以A3-7.4最佳。

基于圖4B 的策略，對nGR-5、bf-Cir-nGR-5 以及Cir-nGR-5 三條序列酶的活性表現(xiàn)情況進行表征，結(jié)果如圖5 所示。實驗結(jié)果顯示三條序列對改造后的底物序列nGR-5whgs 均有明顯酶切，但三者不同的是，相比nGR-5序列，bf-Cir-nGR-5 與Cir-nGR-5 序列酶切后產(chǎn)物的拖尾現(xiàn)象更明顯，推測為酶切后的條帶與酶鏈形成多種結(jié)構(gòu)所致。進一步對酶切樣本進行顯色，發(fā)現(xiàn)nGR-5序列的顏色變化符合設(shè)計預(yù)期，說明該策略用于表征nGR-5系列脫氧核酶的酶切能力是合理的。但是，bf-Cir-nGR-5與Cir-nGR-5 序列的顯色情況卻更為復(fù)雜，相比于nGR-5 序列，bf-Cir-nGR-5、Cir-nGR-5 與nGR-5whgs 結(jié)合后背景信號明顯提升，結(jié)合凝膠電泳結(jié)果，說明這兩者與底物序列的結(jié)合產(chǎn)物類型更多，影響底物上G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)的顯色表現(xiàn)。由此可見，nGR-5whgs 與bf-Cir-nGR-5、Cir-nGR-5 兩條酶鏈結(jié)合后，其G-四聯(lián)體更容易受到酶鏈上其他堿基的影響，同時相比于bf-Cir-nGR-5，Cir-nGR-5上的堿基對G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)的影響更強，在結(jié)合后可能更容易受到序列上其他堿基的影響。

圖5 基于凝膠電泳以及比色實驗的nGR-5系列序列對nGR-5whgs酶切能力的表征Fig.5 Characterization of nGR-5whgs cut by nGR-5 series sequence through colorimetric experiment and gel electrophoresis

結(jié)合Cir-nGR-5 序列的異常表現(xiàn)進一步考察nGR-5whgs 序列的組成及其顯色特性，發(fā)現(xiàn)nGR-5whgs 與Cir-nGR-5 結(jié)合后，其發(fā)夾結(jié)構(gòu)被充分打開，Cir-nGR-5 延伸序列上的C 堿基（圖6A 標紅C 堿基區(qū)域）與G-四聯(lián)體極為靠近，引起了該G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)與Hemin 復(fù)合物的過氧化物酶活性增強，且其增強效果高于發(fā)夾結(jié)構(gòu)引起的A 堿基靠近。隨后本文選擇降低溶液鹽離子濃度影響序列雜交表現(xiàn)的方式對該分析結(jié)果進行初步驗證，結(jié)果如圖6 所示，當(dāng)酶切反應(yīng)所用A3 緩沖液的濃度稀釋12.5 倍后，Cir-nGR-5 序列與nGR-5whgs 結(jié)合后的顯色深度變淺，但相比于bf-Cir-nGR-5 仍然較深，說明酶鏈與底物鏈結(jié)合的強弱直接影響G-四聯(lián)體的顯色表現(xiàn)，進一步證實了以上分析結(jié)果。

圖6 Cir-nGR-5與nGR-5whgs結(jié)合后底物過氧化物酶活性增強原因的初步探究Fig.6 Preliminary study on the reasons for the enhanced peroxidase activity after the combination of Cir-nGR-5 and nGR-5whgs

由此可見，nGR-5 脫氧核酶環(huán)化后，脫氧核酶與底物序列之間的作用模式受到影響，這一特性可為構(gòu)建新型基于脫氧核酶的生物傳感器件提供新思路。

2.2.3 Cir-nGR-5 脫氧核酶環(huán)大小對其酶活性的影響由上述討論可知，Cir-nGR-5 的酶活性相比nGR-5 仍受到一定的影響，綜合各類可能的影響因素，進一步考察了Cir-nGR-5 脫氧核酶環(huán)的大小對其酶活性的影響。實驗通過在Cir-nGR-5 序列原有堿基個數(shù)的基礎(chǔ)上增加和減少4 個堿基，另外合成Cir-nGR-5+4b與Cir-nGR-5-4b兩條序列，并結(jié)合凝膠電泳實驗表征了三條序列對nGR-5whgs底物序列的酶切活性表現(xiàn)情況。其環(huán)形核酸合成與表征結(jié)果如圖7所示，其中酶鏈與底物鏈濃度比為1∶2，酶切反應(yīng)6 h 后的結(jié)果表明Cir-nGR-5+4b 的酶切能力略大于其他兩條序列，這說明適當(dāng)增加環(huán)部堿基個數(shù)能增強Cir-nGR-5序列的酶活性。

圖7 基于凝膠電泳實驗的Cir-nGR-5系列序列合成及其對nGR-5whgs酶切能力的表征Fig.7 Characterization of nGR-5whgs cut by Cir-nGR-5 series sequence and its synthesis results through gel electrophoresis

2.3 nGR-5脫氧核酶系列序列的穩(wěn)定性表征

由圖1C結(jié)果表明，相比于單鏈的bf-Cir-nGR-5序列，Cir-nGR-5具有更好的抗外切酶能力，故進一步通過延長酶切反應(yīng)時間至12 h 考察其在外切酶溶液中的長時穩(wěn)定效果，從圖8A 所示結(jié)果可發(fā)現(xiàn)Cir-nGR-5在12 h內(nèi)穩(wěn)定存在，而單鏈脫氧核酶在1 h后幾乎全部被酶切。結(jié)合脫氧核酶目前可能的應(yīng)用場景，本文還對比考察了Cir-nGR-5 在自來水（室溫）以及胎牛血清（FBS，75%，37oC）中的穩(wěn)定性。圖8B 為bf-Cir-nGR-5 與Cir-nGR-5 序列在自來水中的穩(wěn)定性情況，結(jié)果顯示Cir-nGR-5 相比bf-CirnGR-5 具有更好的穩(wěn)定性，即便過了7 d，Cir-nGR-5 序列的降解也并不明顯。此外，環(huán)形核酸在10%FBS 中的長時穩(wěn)定性已被多次報道，本文通過進一步提高其體積分數(shù)至75%考察了nGR-5、bf-CirnGR-5 以及Cir-nGR-5 三條序列的穩(wěn)定表現(xiàn)，結(jié)果表明環(huán)形脫氧核酶Cir-nGR-5 在6 h 后仍有條帶保留，而單鏈脫氧核酶在2 h后已被酶切完畢。由此可見，環(huán)形脫氧核酶在提升核酸分子穩(wěn)定性上具備一定優(yōu)勢。

圖8 基于凝膠電泳表征的bf-Cir-nGR-5與Cir-nGR-5在不同環(huán)境下的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性Fig.8 Structural stability of bf-Cir-nGR-5 and Cir-nGR-5 in different environments by gel electrophoresis experiment

3 結(jié) 論

本文設(shè)計合成了一條環(huán)形脫氧核酶Cir-nGR-5，并表征了其酶活性以及結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。研究結(jié)果表明環(huán)形結(jié)構(gòu)的引入能明顯增強脫氧核酶結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，具體表現(xiàn)在外切酶樣穩(wěn)定時長大于12 h、在自來水中穩(wěn)定時長大于7 d 以及在75% FBS 中穩(wěn)定時長為6 h 左右，遠高于同類單鏈脫氧核酶。同時，環(huán)形結(jié)構(gòu)的引入不會完全破壞原脫氧核酶的酶活性，但由于其增強了脫氧核酶與其底物序列的相互作用，也會對脫氧核酶原有的酶活性產(chǎn)生影響。但此影響可通過延長反應(yīng)時間得以削弱，且在具體的生物傳感器構(gòu)建中，這一增強作用會影響傳感器的信號表達，如本文對比了基于環(huán)形脫氧核酶與單鏈脫氧核酶分別構(gòu)建的同類熒光生物傳感器，底物序列被前者酶切后的熒光信號相比后者有明顯增強，這一特性也為脫氧核酶生物傳感器的設(shè)計提供了更多可能性。綜上，環(huán)形結(jié)構(gòu)能較好地改進脫氧核酶的穩(wěn)定性，也能增強脫氧核酶與底物序列的相互作用，這將為開發(fā)基于脫氧核酶的相關(guān)生物傳感器提供新思路。